[PDF] Molekulare Analysen zur Knochenregeneration im Alter und bei Osteoporose

1 Molekulare Analysen zur Knochenregeneration im Alter und bei Osteoporose Dissertation zur Erlangung des naturwissensch...

Molekulare Analysen zur Knochenregeneration im Alter und bei Osteoporose

Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades der Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von

Peggy Benisch geboren in Zeitz

Würzburg, 2011

Eingereicht am:

Mitglieder der Promotionskommission: Vorsitzender: Prof. Dr. Thomas Dandekar Gutachter:

Prof. Dr. Franz Jakob

Gutachter:

Prof. Dr. Georg Krohne

Tag des Promotionskolloquiums:

Doktorurkunde ausgehändigt am:

Hiermit erkläre ich ehrenwörtlich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig angefertigt und keine anderen als die von mir angegebenen Hilfsmittel und Quellen verwendet habe. Des Weiteren erkläre ich, dass diese Arbeit weder in gleicher noch in ähnlicher Form in einem Prüfungsverfahren vorgelegen hat und ich noch keinen Promotionsversuch unternommen habe.

Würzburg, 04.03.2011

Peggy Benisch

Inhaltsverzeichnis 1 2 3

Zusammenfassung ........................................................................................................................... 1 Summary.......................................................................................................................................... 2 Einleitung ......................................................................................................................................... 3 3.1 Knochenhomöostase ............................................................................................................... 3 3.1.1 Knochenumbau ................................................................................................................... 4 3.1.1.1 Knochenabbau ............................................................................................................. 4 3.1.1.2 Knochenaufbau............................................................................................................ 5 3.1.2 Quelle der Regeneration: Mesenchymale Stammzellen (MSC) .......................................... 7 3.1.3 Steuerung des Knochenumbaus .......................................................................................... 8 3.1.3.1 WNT-Signalweg ........................................................................................................... 8 3.1.3.2 BMP-Signalweg ............................................................................................................ 9 3.1.3.3 Wachstumsfaktoren .................................................................................................. 10 3.1.3.4 Mechanotransduktion ............................................................................................... 12 3.1.3.5 Hormonelle Steuerung .............................................................................................. 13 3.2 Alterung ................................................................................................................................. 15 3.2.1 Alterung des Organismus .................................................................................................. 15 3.2.2 Zelluläre Seneszenz ........................................................................................................... 15 3.2.3 Ursachen für Alterung ....................................................................................................... 17 3.2.3.1 Telomere ................................................................................................................... 17 3.2.3.2 DNA- Reparatur ......................................................................................................... 17 3.2.3.3 Oxidativer Stress ........................................................................................................ 18 3.2.3.4 Proliferationsstress und Mitogene ............................................................................ 18 3.2.3.5 Epigenetik .................................................................................................................. 19 3.2.3.6 Genetische Prädisposition ......................................................................................... 20 3.2.4 Immunseneszenz ............................................................................................................... 20 3.2.5 Auswirkung der Alterung auf Knochenhomöostase .......................................................... 22 3.2.5.1 Auswirkungen der Alterung auf MSC ........................................................................ 22 3.3 Osteoporose .......................................................................................................................... 24 3.3.1 Gestörte Knochenhomöostase bei Osteoporose .............................................................. 24 3.3.2 Ursachen für Osteoporose ................................................................................................ 24 3.3.2.1 Alterung ..................................................................................................................... 24 3.3.2.2 Veränderungen im Hormonspiegel ........................................................................... 24 3.3.2.3 Verhalten ................................................................................................................... 25 3.3.2.4 Genetik ...................................................................................................................... 25 3.3.3 MSC und Osteoporose ....................................................................................................... 26 3.4

Ziel der Arbeit ........................................................................................................................ 26

Material und Methoden ................................................................................................................ 27 4.1 Material ................................................................................................................................. 27 4.1.1 Geräte ................................................................................................................................ 27 4.1.2 Verbrauchsmaterial ........................................................................................................... 28 4.1.3 Chemikalien/ Reagenzien .................................................................................................. 28 4.1.4 Kits ..................................................................................................................................... 30 4.1.5 Primer ................................................................................................................................ 31 4.1.5.1 Primer für semi-quantitative PCR .............................................................................. 31 4.1.5.2 Sequenzierungsprimer .............................................................................................. 33

4.1.6 Enzyme .............................................................................................................................. 33 4.1.7 Antikörper.......................................................................................................................... 33 4.1.7.1 Primärantikörper ....................................................................................................... 33 4.1.7.2 Sekundärantikörper ................................................................................................... 34 4.1.8 Proteine ............................................................................................................................. 34 4.1.9 Kompetente Bakterien ...................................................................................................... 34 4.1.10 Vektoren ........................................................................................................................ 35 4.1.11 Software und Internet-Seiten ........................................................................................ 35 4.1.1 Lösungen für Molekularbiologie und Proteinbiochemie ................................................... 36 4.1.2 Bakteriennährmedien/-nährboden ................................................................................... 39 4.1.3 Zellkulturmedien ............................................................................................................... 39 4.2 Methoden .............................................................................................................................. 40 4.2.1 Molekularbiologische Methoden ...................................................................................... 40 4.2.1.1 Isolation von zellulärer RNA ...................................................................................... 40 4.2.1.2 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren ....................................................... 40 4.2.1.3 Reverse Transkription................................................................................................ 40 4.2.1.4 Semi-quantitative Polymerase Kettenreaktion (PCR) ............................................... 41 4.2.1.5 Agarosegelelektrophorese ........................................................................................ 42 4.2.1.6 Densitometrie ............................................................................................................ 42 4.2.1.7 Agarosegel-Eluation................................................................................................... 42 4.2.1.8 DNA-Sequenzierung .................................................................................................. 43 4.2.1.9 Methoden der Klonierung von DNA-Sequenzen ....................................................... 44 4.2.1.10 Klonierung für die Expression von SAA1 und SAA2 ................................................... 45 4.2.1.11 Präparation von Plasmid-DNA ................................................................................... 46 4.2.2 Zellbiologische Methoden ................................................................................................. 47 4.2.2.1 Isolierung von humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) .............................. 47 4.2.2.2 Kultivierung von eukaryotischen Zellen .................................................................... 47 4.2.2.3 Bestimmung der Zellzahl und Berechnung der Populationsverdopplung................. 48 4.2.2.4 In vitro-Alterung von hMSC ....................................................................................... 48 4.2.2.5 Kryokonservierung von hMSC-TERT .......................................................................... 48 4.2.2.6 Osteogene Differenzierung von hMSC und hMSC-TERT ........................................... 48 4.2.2.7 Applikation von rekombinantem, humanem SAA1 in der Zellkultur ........................ 49 4.2.2.8 Stabile Transfektion von hMSC-TERT ........................................................................ 49 4.2.3 Protein-biochemische Methoden...................................................................................... 49 4.2.3.1 Isolation von zellulärem Protein................................................................................ 49 4.2.3.2 Konzentrationsbestimmung von Proteinen .............................................................. 49 4.2.3.3 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) ................................................... 50 4.2.3.4 Western-Blot ............................................................................................................. 51 4.2.3.5 Messung der Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase-Aktivität .............................. 51 4.2.4 Cytochemische Färbungen ................................................................................................ 52 4.2.4.1 Seneszenz-assoziierte β-Galaktosidase-Färbung....................................................... 52 4.2.4.2 Alizarin Rot S-Färbung ............................................................................................... 52 4.2.5 Immuncytochemische Färbungen ..................................................................................... 52 4.2.6 Mikroarray-Analysen ......................................................................................................... 53 4.2.6.1 Microchip-Hybridisierung .......................................................................................... 53 4.2.6.2 Statistische Auswertung von Mikroarray-Daten ....................................................... 54 5

Ergebnisse...................................................................................................................................... 55 5.1 Mikroarray-Analysen ............................................................................................................. 55 5.1.1 Aufarbeitung der Mikroarray-Daten ................................................................................. 55 5.1.2 Mikroarray-Analysen von in-vivo-gealterten hMSC .......................................................... 56 5.1.2.1 Differentielle Genexpression in in-vivo-gealterten hMSC ......................................... 56

5.1.2.2 Statistische, funktionelle Analyse mittels GOstat ..................................................... 57 5.1.2.3 Biologische Evaluierung der Mikroarray-Ergebnisse zur in-vivo-Alterung ................ 58 5.1.3 Mikroarray-Analysen von seneszenten hMSC................................................................... 60 5.1.3.1 Differentielle Genexpression in seneszenten hMSC ................................................. 60 5.1.3.2 Statistische, funktionelle Analyse mittels GOstat ..................................................... 61 5.1.3.3 Biologische Evaluierung der Mikroarray-Ergebnisse zur Seneszenz ......................... 62 5.1.4 Mikroarray-Analysen von Osteoporotischen hMSC .......................................................... 65 5.1.4.1 Differentielle Genexpression in hMSC-OP................................................................. 65 5.1.4.2 Statistische, funktionelle Analyse mittels GOstat ..................................................... 65 5.1.4.3 Biologische Evaluierung der Mikroarray-Ergebnisse zur Osteoporose ..................... 66 5.1.5 Vergleich in-vivo-Alterung, Seneszenz und Osteoporose ................................................. 69 5.1.5.1 Vergleich in-vivo-Alterung und Seneszenz ................................................................ 70 5.1.5.2 Vergleich Osteoporose und in-vivo-Alterung ............................................................ 74 5.1.5.3 Vergleich Osteoporose mit Seneszenz ...................................................................... 76 5.2 Kandidatengene der Seneszenz............................................................................................. 77 5.2.1 Nachweis der Seneszenz in hMSC ..................................................................................... 77 5.2.2 Kandidatengensuche ......................................................................................................... 81 5.2.3 A-SAA – Auswirkung auf die Funktion von hMSC .............................................................. 83 5.2.3.1 Einfluss von A-SAA auf die Seneszenz ....................................................................... 83 5.2.3.2 Stimulation mit rhSAA1 während osteogener Differenzierung ................................ 84 5.2.3.3 Charakterisierung von stabil mit SAA1 bzw. SAA2 transfizierten hMSC-TERT .......... 86 5.2.4 HELLS – Expressionsmuster während der in-vitro-Alterung von hMSC ............................ 89 5.3 Kandidatengene der Osteoporose ........................................................................................ 92 5.3.1 Kandidatengensuche ......................................................................................................... 92 5.3.2 Sclerostin – prämature Expression in hMSC...................................................................... 95 6

Diskussion ...................................................................................................................................... 97 6.1 Systembiologie versus statistische Aufarbeitung der Mikroarray-Daten ............................. 97 6.2 In-vivo-Alterung ..................................................................................................................... 98 6.2.1 In-vivo-Alterung verändert das Genexpressionsmuster in hMSC ..................................... 98 6.2.1.1 Reproduzierbare Genexpressionsänderungen trotz Spendervariabilität ................. 98 6.2.1.2 Eingeschränkte Funktion von in-vivo-gealterten hMSC ............................................ 99 6.3 Seneszenz ............................................................................................................................ 100 6.3.1 In-vitro-Alterung von hMSC ist ein geeignetes Seneszenz-Modell ................................. 101 6.3.2 hMSC zeigen in Kultur bereits früh Anzeichen von Seneszenz........................................ 101 6.3.3 Seneszenz verändert das Genexpressionsmuster in hMSC ............................................. 102 6.3.3.1 Reproduzierbare Genexpressionsänderungen ........................................................ 103 6.3.3.2 Eingeschränkte Funktion von seneszenten hMSC ................................................... 103 6.3.4 Seneszenz versus Alterung .............................................................................................. 105 6.3.4.1 Wenige Überlappungen im differentiellen Genexpressionsmuster........................ 105 6.3.4.2 Ähnliche Störungen trotz unterschiedlicher Genexpressionsmuster ..................... 106 6.4 Osteoporose ........................................................................................................................ 107 6.4.1 Das Transkriptom osteoporotischer hMSC ist verändert ................................................ 107 6.4.1.1 Reproduzierbare Genexpressionsänderungen trotz Spendervariabilität ............... 107 6.4.1.2 Die Änderungen im Genexpressionsmuster sind different von Spendern gleichen Alters ohne Osteoporose......................................................................................................... 108 6.4.2 hMSC-OP zeigen Anzeichen von Seneszenz .................................................................... 110 6.5 Mittels Mikroarray-Analysen ermittelte Kandidatengene .................................................. 111 6.5.1 A-SAA – Mineralisierungsförderer und Marker für Stress .............................................. 111 6.5.1.1 Erhöhte A-SAA-Expression: Seneszenz versus Krebs............................................... 111

6.5.1.2 A-SAA fördert die Mineralisierung .......................................................................... 112 6.5.1.3 Stress stimuliert Expression von A-SAA und Metalloproteinasen........................... 113 6.5.2 HELLS – Verlust der Genexpression als neuer Marker für Seneszenz ............................. 114 6.5.3 SOST – ein Marker für Osteoporose in hMSC.................................................................. 115 6.6 6.7 7 8

Zusammenfassung Diskussion ............................................................................................. 117 Ausblick................................................................................................................................ 118

Literaturverzeichnis ..................................................................................................................... 120 Anhang......................................................................................................................................... 140 8.1 Zusatzmaterial ..................................................................................................................... 140 8.1.1 SAM-Ergebnisse zur differentiellen Genexpression ........................................................ 140 8.1.1 GOstat-Analysen .............................................................................................................. 156 8.1.1 Ranglisten ........................................................................................................................ 178 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7

Abkürzungen........................................................................................................................ 189 Abbildungsverzeichnis ......................................................................................................... 191 Tabellenverzeichnis ............................................................................................................. 192 Lebenslauf ..........................................................................Fehler! Textmarke nicht definiert. Veröffentlichungen und Kongressbeiträge ......................................................................... 193 Danksagung ......................................................................................................................... 195

Zusammenfassung

1 Zusammenfassung Mesenchymale Stammzellen (MSC) stellen die Grundlage der Knochenformation dar, indem sie als multipotente Zellen in viele, für die Knochenhomöostase benötigte Zelltypen differenzieren können, wie z.B. Osteoblasten. Während der Alterung des Menschen kommt es zu einem Ungleichgewicht zwischen Knochenaufbau und Knochenabbau, resultierend in einer verringerten Knochenmasse. Noch ist unklar, ob MSC an dem verminderten Knochenaufbau direkt beteiligt sind, indem sie z.B.im Laufe der Zeit Funktionsstörungen akkumulieren oder in die Seneszenz eintreten, und somit nicht mehr als Stammzellpool für die Osteoblastendifferenzierung zur Verfügung stehen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Genexpressionsmuster gealterter Zellen mittels MikroarrayAnalysen untersucht, um die Alters-bedingten Veränderungen detektieren zu können. Hierfür wurde ein in-vitro-Alterungsmodell von humanen MSC (hMSC) etabliert, um die seneszenten Zellen mit hMSC früher Kultivierungspassagen zu vergleichen. Auch Zellen aus Spendern hohen Alters wurden untersucht, um einen Vergleich zwischen ex-vivo- und in-vitro-gealterten hMSC anstellen zu können. Da Osteoporose eine polygenetische Erkrankung des gealterten Knochens darstellt, wurden auch mit hMSC aus Osteoporose-Patienten Genexpressionsanalysen durchgeführt. Die Mikroarray-Analysen und anschließende systembiologische Auswertung zeigten, dass in-vitrogealterte, seneszente hMSC starke Veränderungen im Transkriptom aufweisen, die auf Defizite in der Proliferation, Differenzierungskapazität und Migration schließen lassen. Neben bekannten Markern für replikative Seneszenz konnten in hMSC auch neue detektiert werden, wie z.B. HELLS, POU5F1 (OCT4) und FGFR2, deren Expression mit der Seneszenz abnimmt, oder CDH1 und PSG5, deren Expression zunimmt. Gene für Akute-Phase-SAA wurden stark erhöht exprimiert vorgefunden. Bei der funktionellen Charakterisierung konnte jedoch gezeigt werden, dass SAA1 und SAA1 durch Stress induziert werden, der der Seneszenz vorausgeht, und dass sie die Mineralisierung bei der osteogenen Differenzierung von hMSC fördern. Akute-Phase-SAA könnten somit eine Verbindung zwischen Alterung bzw. Inflammation und extra-skelettaler Verkalkung darstellen, die im Alter häufig auftritt, z.B. in Form von Arteriosklerose. In-vivo-gealterte hMSC wiesen ebenfalls Defizite im Expressionsmuster von Proliferations- und Migrations- relevanten Genen auf. Des Weiteren konnten nur wenige Gemeinsamkeiten zwischen invivo-gealterten hMSC und in-vitro-gealterten hMSC festgestellt werden. Dies lässt vermuten, dass die in-vivo-Alterung nicht zwangsläufig zu seneszenten Stammzellen führt, da Alterung eines Organismus ein multizellulärer Prozess ist, der durch viele Faktoren beeinflusst wird, wie z.B. Akkumulation von Mutationen und Krebsabwehr. Auch osteoporotische hMSC wiesen Veränderungen im Genexpressionsmuster auf, die mit den Daten zur in-vivo-Alterung verglichen wurden, um die rein Alters-assoziierten Änderungen herausfiltern zu können. Die übrig gebliebenen Gene repräsentierten Veränderungen allein aufgrund der Krankheit. Osteoporose bewirkte somit distinkte Genexpressionsänderungen in hMSC, die auf Förderung der Osteoklastogenese und Defizite in Proliferation, Migration und Differenzierungskapazität schließen lassen. Es konnten vielversprechende Kandidatengene für osteoporotische hMSC gefunden werden. Die prämature Expression des WNT-Inhibitors SOST (Sclerostin) und die Überexpression des BMP-Signalweg-Inhibitors MAB21L2 deuten auf eine Autoinhibition der Stammzellen hin, die letztlich die gestörte Knochenformation bei Altersassoziierter Osteoporose begründen könnte. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass intrinsische Defizite von Stammzellen an der Pathophysiologie von Alterung und Osteoporose beteiligt sind. Sie eröffnet tiefgreifende Einblicke in die systembiologischen Veränderungen in Stammzellen aufgrund von Alterung oder Osteoporose, und setzt somit einen soliden Grundstein für weiterführende Analysen.

Summary

2 Summary Mesenchymal stem cells (MSC) represent the basis of bone formation, because as multipotent cells they can differentiate into many cell types important for bone homeostasis, e.g. osteoblasts. During aging an imbalance between bone formation and bone resorption occurs, which results in reduced bone mass. It is still unclear whether MSC biology is directly involved in reduced bone formation, e.g. by accumulating malfunctions in aged organisms or by entering replicative senscence. Thereby they would no longer function as a regenerative source for osteogenesis. In this study, the gene expression pattern of aged human MSC (hMSC) was analyzed by microarray hybridizations to determine aging-associated changes in those cells. Therefore, a model for in vitro aging was established and the gene expression pattern of senescent hMSC was compared with the pattern of hMSC in early passages. Moreover, cells isolated from patients of old age were analyzed to perform a comparison between ex-vivo and in vivo aging. Human MSC of patients diagnosed with osteoporosis were also examined because osteoporosis is a polygenetic disease of aged bone. Systems biology based interpretation of the microarray data revealed changes on the mRNA level in in vitro aged hMSC that indicate deficits in proliferation, differentiation capacity and migration. Additionally to known markers of replicative senescence in hMSC, new markers were detected, e.g. reduced expression of HELLS, POU5F1 (OCT4), and FGFR2, as well as higher expression of CDH1 and PSG5. Furthermore, genes for acute phase SAA proteins showed extremely high expression in senescent hMSC. Functional characterization of SAA1 and SAA2 revealed that the expression is rather a consequence of stress that precedes senescence than of replicative senescence itself. SAA also increases mineralization of osteogenic differentiated hMSC and could therefore be involved in ageor inflammation-associated extraskeletal calcification, e.g. arteriosclerosis. In vivo aged hMSC also showed deficiency in proliferation and migration on mRNA level. Furthermore on the gene expression level, in vivo aged and in vitro aged hMSC shared only few similarities. Those findings suggest that in vivo aging does not necessarily results in senescent stem cells, because the aging of an organism is a multicellular process, which is influenced by many other factors, e.g. accumulation of mutations and tumor defense. Osteoporotic hMSC also showed changes in their gene expression pattern. By comparing those data with the results of hMSC from age-matched patients, age-associated changes could be eliminated. All remaining genes with differential expression represented osteoporosis-related changes that indicated deficiencies in proliferation, migration and differentiation capacity. There were hints for enhancement of osteoclastogenesis by osteoporotic hMSC and promising candidates for osteoporosis with respect to inhibition of osteogenesis were detected. SOST (sclerostin) acts as an inhibitor for WNT signaling and MAB21L2 as an inhibitor for BMP signaling. Both genes were expressed to a higher extent in osteoporotic hMSC, which indicates autoinhibition of the stem cells and could lead to the reduced bone formation in osteoporosis. In summary, this study indicates that intrinsic alterations in stem cell biology are involved in the pathophysiology of aging and osteoporosis. It opens up profound insights into changes in systems biology of hMSC due to aging or osteoporosis which provide a broad basis for further analyses.

Einleitung

3 Einleitung

3.1 Knochenhomöostase Knochengewebe ist eine spezialisierte Form des Bindegewebes. Es besteht hauptsächlich aus einer mineralisierten Matrix, die sich aus miteinander verknüpften Kollagen fasern und Hydroxylapatit (Kalziumphosphatsalz) zusammensetzt. Knochen bildet die Stütze des Körpers und stellt ein Reservoir für Kalzium und Phosphat, sowie einen Ort für die Hämatopoese dar. Die Röhrenknochen des Erwachsenen sind Lamellenknochen und setzten sich aus zwei Schichten zusammen: der äußeren, kompakten Schicht Substantia compacta und einer inneren Schicht, die aus schwammartig aufgebauten Knochenbälkchen und dem Knochenmark besteht, die Substantia spongiosa. Die Knochenbälkchen und das Innere des Knochens sind von einer dünnen Bindegewebsschicht umgeben, dem Endosteum. Den äußeren Knochen hüllt das dickere Periost ein. Die Untereinheiten der knöchernen Bestandteile des Lamellenknochens sind die Osteone, dicke Lamellen parallel zur Längsachse des Knochens, die sich aus konzentrischen Schichten um einen zentralen Kanal zusammensetzen (Abb. 1). Dieser Kanal, auch Havers-Kanal genannt, enthält Nervenzellen und Blutgefäße. Im Durchschnitt bestehen Osteone aus 6-7 Schichten. Diese sind ca. 4 mm lang und 200 mm breit. Osteozyten

Substantia compacta Osteon

Substantia spongiosa

Kanalikuli

Havers-Kanal

Nerven

Periost Volkmann-Kanal

Blutgefäße

Abb. 1 Aufbau des Lamellenknochens nach (Bartl 2008) und (Robling and Stout 1999)

Die Osteone stehen untereinander und mit dem Endost, dem Knochenmark und dem Periost über weitere Kanäle (Volkmann-Kanäle) in Verbindung, durch die auch der Austausch von endokrinen Faktoren und Signalmolekülen erfolgt. Die Osteone stellen jene Einheit des Knochens dar, an der die knochenrelevanten Zellen den Knochenumbau durchführen. Zu den Knochenzellen gehören zum einen die Osteozyten, die sich in den konzentrischen Schichten der Osteone direkt in der Knochenmatrix befinden. Sie sind dort in Lakunen lokalisiert, und über Gap Junctions ihrer in Kanalikuli verlaufenden, dendritenartigen Ausläufer stehen sie untereinander in Kontakt. Die Kanalikuli sind auch mit den Kanälen des Osteoms verbunden, wodurch die Kommunikation der Zellen mit den restlichen Knochenzellen ermöglicht wird (Noble 2008). Die nicht proliferierenden Osteozyten entstehen aus Osteoblasten, die wiederum über Präosteoblasten aus Mesenchymalen Stammzellen (siehe 3.1.2) differenzieren. Die Osteoblasten bauen den Knochen durch Sezernierung von Matrixproteinen auf, die letztendlich mineralisieren. Die Matrix wiederum ist von sogenannten 3

Einleitung „Lining-cells“ umgeben, ebenfalls terminal differenzierte Osteoblasten, die nicht am Aufbau der Matrix beteiligt sind und deren Funktion zum Teil noch unbekannt ist. Ein letzter wichtiger Zelltyp des Knochens sind die Osteoklasten, Zellen aus der hämatopoetischen Reihe, die mineralisierte Knochenmatrix abbauen können (Junqueira et al. 2002; Clarke 2008).

3.1.1

Knochenumbau

Knochen ist ein dynamisches Gewebe, das ein Leben lang kontinuierlich resorbiert und erneut geformt wird. Diese Umbauten des Knochens werden angeregt durch mechanische Beanspruchung, zur Regulation des extrazellulären Kalzium- und Phosphatlevels und als Antwort auf parakrine und autokrine Faktoren, sowie hormonelle Veränderungen. Abgesehen von der Kindheit – in der die Ossifikation erst abgeschlossen wird –, im Alter oder bei Defekten im Knochenmetabolismus ist das Verhältnis von Knochenabbau zu Knochenaufbau im Gleichgewicht, es liegt eine Homöostase vor. Neben den knochenbildenden Osteoblasten, den knochenresorbierenden Osteoklasten und den in der Matrix verankerten Osteozyten spielen weitere Zellen des Knochenmarks, wie z.B. TLymphozyten, B-Zellen und Erythrozyten, sowie neurale Zellen bei diesen Umbauvorgängen eine Rolle (Sims and Gooi 2008). 3.1.1.1

Knochenabbau

Der Knochenabbau wird von Osteoklasten durchgeführt und dauert in einem Osteon von Beginn bis Ende ca. 2-3 Wochen (Harada and Rodan 2003). Osteoklasten bilden sich aus mononukleären, hämatopoetischen Stammzellen, indem sie zu multinukleären Zellen fusionieren. Nach einem Resorption fördernden Stimulus (siehe 3.1.3) werden die Stammzellen über chemische Lockstoffe, die von Osteoblasten, „Lining-cells“, Osteozyten oder der Knochenmatrix sezerniert werden, an den betroffenen Bereich des Knochens rekrutiert (Abb. 2). Zu den Chemoattraktantien zählen Osteocalcin/BGLAP (bone gamma-carboxyglutamate protein), AHSG (alpha-2-HS-glycoprotein), Sphingosin-1-Phosphat und Kollagen Typ 1-Fragmente (Malone et al. 1982; Pederson et al. 2008; Ishii et al. 2009). Die Proliferation der Osteoklastenvorläuferzellen wird über den von Osteoblasten sezernierten Faktor CSF1 (colony stimulating factor 1) angeregt (Sims and Gooi 2008).

Abb. 2 Induktion der Osteoklastogenese.Zellen der Osteoblasten-Linie sind in Blautönen gehalten, wobei abgeflachte Zellen „Lining-cells“ und in der Knochenmatrix verankerte Zellen Osteozyten darstellen. Hämatopoetische Vorläuferzellen sind in Rosa dargestellt, und ausgereifte Osteoklasten in Rot. (Sims and Gooi 2008)

Einleitung Die Fusion der hämatopoetischen Stammzellen wird ebenfalls von Osteoblasten gesteuert. Sezernierte Faktoren der Osteozyten und anderer umliegender Zellen – z.B. Immunzellen – führen zur Expression des membrangebundenen RANKL/TNFSF11 (tumor necrosis factor superfamily, member 11, ligand) auf Osteoblasten. Zu diesen Faktoren zählen z.B. Il11 (interleukin 11), Prostaglandin E2, PTHLH/PTHrP (parathyroid hormone-like hormone) und Oncostatin M (kodiert von OMS). RANKL ist ein Ligand für den membrangebundenen Rezeptor RANK/TNFRSF11A (tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11a, NFKB activator) der Osteoklasten und der Schlüsselfaktor für die Einleitung der Fusion von Vorläuferzellen zu mehrkernigen Osteoklasten. Die RANK/RANKL-Interaktion induziert in den hämatopoetischen Vorläuferzellen die Expression von membranständigen Fusionsproteinen, wie z.B. ATP6V0D2 (ATPase, H+ transporting, lysosomal 38kDa, V0 subunit d2 ), DCSTAMP (DC-specific transmembrane protein) oder DAP12 (DNAX adaptor protein 12) (Horwood et al. 1998; Palmqvist et al. 2002; Sims and Gooi 2008). Osteoblasten produzieren einen weiterer RANKL-Rezeptor, das lösliche OPG/ TNFRSF11B (osteoprotegerin/ tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11b). Die Bindung von RANKL an OPG führt zu keiner Aktivierung eines Signalweges, sondern dient dazu, die Bindung von RANKL an RANK zu blockieren und damit die Bildung multinukleärer Osteoklasten zu verhindern. Durch Regulation des Verhältnisses von RANKL zu OPG können die Osteoblasten die Osteoklastogenese, und damit letztendlich die Knochenmasse präzise regulieren (Simonet et al. 1997). Der lokale Knochenumbau findet in sogenannten, temporären Knochenumbaukammern statt, die von „Lining-cells“ gebildet werden. Es wird angenommen, dass diese Zellen auf Grund der Resorption einleitenden Faktoren dazu angeregt werden, Kollagenase frei zu setzen. Dieses Enzym zerstört die nicht-mineralisierte Matrix (Osteoid), die der mineralisierten Matrix aufliegt. Anschließend lösen sich die „Lining-cells“als geschlossene Schicht von der Matrix ab und bilden eine Kammer (Abb. 2) (Sims and Gooi 2008). Es wird angenommen, dass Vorläuferzellen von Osteoblasten und Osteoklasten über den Blutkreislauf durch Mikrogefäße in diese Knochenumbaukammern transportiert werden, damit der Knochenumbau stattfinden kann (Matsuo 2009). Die Osteoklasten haften auf der Matrix mittels Integrinen, die mit Osteopontin (codiert vom Gen SSP1; secreted phosphoprotein 1) und IBSP (integrin-binding sialoprotein) interagieren. Beide Faktoren wurden im vorangegangen Knochenaufbau-Zyklus von Osteoblasten in der Matrix hinterlassen (Ross and Teitelbaum 2005). Die Osteoklasten bewegen sich mittels Podosomen fort und sezernieren Salzsäure für die Zerstörung des Hydroxylapatids der Matrix und Hydrolasen für den Verdau von Kollagen und anderen Matrixproteinen. Die dabei anfallenden Abbauprodukte werden von den Osteoklasten phagozytiert. Wenn die Resorption beendet ist, werden die Zellen apoptotisch und lösen sich von der Matrix ab (Sims and Gooi 2008). 3.1.1.2

Knochenaufbau

Die anschließende Knochenbildung benötigt deutlich mehr Zeit als die Resorption: ca. 3 Monate (Harada and Rodan 2003). Eingeleitet wird sie von den Faktoren, die beim Verdau der Matrix durch Osteoklasten freigesetzt wurden. Diese Faktoren sind u.a. IGF1 (insulin-like growth factor 1), FGF2 (fibroblast growth factor 2), TGFB1 (transforming growth factor, beta 1), BMP2, 3, 4, 6 und 7 (bone morphogenetic protein), S1P (sphingosine 1-phosphate) und PDGF (platelet-derived growth factor). Sie dienen zur Rekrutierung von Mesenchymalen Stammzellen (siehe 3.1.2) und deren Differenzierung zu Osteoblasten (Ozaki et al. 2007; Ponte et al. 2007; Habisch et al. 2008; Pederson et al. 2008; Sims and Gooi 2008). Osteoklasten sezernierten u.a. den Faktor CT-1 (Cardiotropin 1). Dieser leitet die Differenzierung ein, indem er als Ligand für LIF-Rezeptoren oder GP130 auf Osteoblastenvorläufern wirkt (Abb. 3) (Sims and Gooi 2008). Die Osteoblasten bilden neues Osteoid durch Sezernierung von COL1A1 (collagen, type I, alpha 1) und COL1A2, Osteopontin, IBSP, sowie des Kalzium-bindenden Proteins Osteocalcin (Blair et al. 2002; Ross and Teitelbaum 2005). Die Proteine COL1A1 und COL1A2 bilden in einem Verhältnis von 2:1 eine Tripelhelix, das Kollagen Typ 1, das sich zu Kollagenfibrillen zusammen lagert (Alberts 2008).

Einleitung

Abb. 3 Kontrolle des Knochenumbaus. In rot ist ein Osteoklast dargestellt, in blau sind Zellen der Osteoblasten-Linie gekennzeichnet, wobei die abgeflachten Zellen „Lining-cells“ darstellen. In Gelb ist die Knochenmatrix mit den darin enthaltenen Osteozyten gehalten, dunkleres Gelb stellt Osteoid dar. Die Osteoblasten stehen über Gap Junctions in Verbindung (Pfeile mit Kasten) und können Gebiete der Knochenresorption wahrnehmen (Doppelpfeile). Von Osteozyten sezerniertes Sclerostin kann die Knochenformation hemmen (siehe 3.1.3.1). (Sims and Gooi 2008)

Ein membrangebundener Faktor der Osteoklasten, EFNB2 (ephrin-B2) führt nach Bindung an den osteoblastären Rezeptor EPHB4 (EPH receptor B4) ebenfalls zu Osteoblastendifferenzierung und Knochenbildung (Abb. 3). Die Bindung von Ligand an den Rezeptor löst jedoch auch in Osteoklasten eine Reaktion aus, die die weitere Differenzierung dieser Zellen, und somit den Knochenabbau stoppt. Unter bestimmten Bedingungen – stimuliert durch den parakrinen Faktor PTHLH (siehe 3.1.3.5.1) – exprimieren Osteoblasten den Liganden EFNB2 selbst (Abb. 3). Eine Blockade der EFNB2EPHB4-Interaktion in Osteoblasten führt in-vitro zu verminderter Mineralisierung (Zhao et al. 2006; Allan et al. 2008). Auch die Kommunikation der Osteoblasten untereinander ist notwendig für die Knochenformation, daher stehen die Zellen während der Matrixbildung über Gap Junctions in Verbindung (Abb. 3) (Sims and Gooi 2008). Wenn die Sezernierung von Osteoid allmählich nachlässt, bilden die Osteoblasten durch polarisierte Knospung Matrixvesikel aus, mit deren Hilfe die Mineralisierung stattfindet. Diese Vesikel enthalten u.a. CA (carbonic anhydrase), Lipide mit hoher Affinität zu Kalzium und an der Membran verankertes TNSALP (tissue non-specific alkaline phosphatase). Über spezialisierte Transporter in der Membran gelangen Kalzium- und Phosphat in die Vesikel und formen dort Hydroxylapatit, das anschließend wieder in den extrazellulären Raum abgegeben wird. Kalziumbindende Proteine wie ISBP unterstützen diesen Transport (Orimo 2010). Für die Bildung von Hydroxylapatit ist das Verhältnis von Phosphat (Pi) zu Pyrophosphat (PPi) entscheidend. PPi blockiert die Bildung von Hydroxylapatit, kann aber durch TNSALP (kodiert von ALPL) unter Entstehung von Pi hydrolysiert werden (Terkeltaub 2001; Addison et al. 2007). TNSALP-/- Mäuse weisen eine skelettale Hypomineralisierung auf und untermauern die Bedeutung dieses Enzyms für die Aushärtung der Knochenmatrix (Narisawa et al. 1997). Die Expression von TNSALP wird durch CSF3/G-CSF (granulocyte colony stimulating factor 3), Retinsäure und Vitamin D3 gefördert (Orimo 2010). Nachdem die Osteoblasten den Kochenaufbau beendet haben, können sie zu inaktiven „Lining-cells“ oder aber Osteozyten differenzieren. Die während der Mineralisierung in die Matrix eingeschlossenen Osteozyten regulieren die Knochenformation ebenfalls aktiv, indem sie das Protein Sclerostin (kodiert von SOST) sezernieren, das über die Kanalikuli an die Knochenoberfläche gelangt. Über die Inhibition des WNT- und/oder des BMP-Signalweges (siehe 3.1.3 und 3.1.3.2) inhibiert Sclerostin die Proliferation von Präosteoblasten, sowie die Mineralisierung und fördert die Apoptose von Osteoblasten (ten Dijke et al. 2008; Galli et al. 2010). Auf diese Art wird durch die Osteozyten der Knochenaufbau gestoppt. Funktionseinschränkende Mutationen in SOST wurden in der Van Buchems Krankheit und bei Sklerosteose entdeckt. Beide Krankheiten sind durch hohe Knochendichte gekennzeichnet, die aufgrund des Fehlens von funktionellem Sclerostin auf einer erhöhten Anzahl an aktiven Osteoblasten beruht (Sims and Gooi 2008; ten Dijke et al. 2008). Sklerosteose ist die schwerwiegendere der beiden Krankheiten.

Einleitung

3.1.2

Quelle der Regeneration: Mesenchymale Stammzellen (MSC)

Stammzellen des adulten Organismus dienen dem Zweck, kontinuierlich reife, funktionstüchtige Zellen für Gewebeumbau und Geweberegeneration zur Verfügung zu stellen, um die Funktion der Organe aufrecht zu erhalten. MSC sind adulte, multipotente Stammzellen, die hauptsächlich aus dem Knochenmark, aber auch aus Nabelschnurblut, Bindegewebe, Fettgewebe, synovialen Flüssigkeiten, Plazenta und Zähnen isoliert werden können (Sethe et al. 2006). Je nach residierendem Gewebe, sind die Zellen mit ähnlichen, aber geringfügig veränderten Eigenschaften ausgestattet; ihre genomische Struktur kann variieren (Jakob et al. 2008; Valtieri and Sorrentino 2008). Wie bei allen Stammzellen wird angenommen, dass MSC die Fähigkeit zur Selbsterneuerung besitzen. Der eindeutige Beweis ist jedoch noch offen (Kuhn and Tuan 2010). Anders als pluripotente, embryonale Stammzellen können sie – auch abhängig von der Lokalisation im Körper – nur in eine begrenzte Anzahl an Zelltypen differenzieren: Osteoblasten, Adipozyten, Chondrozyten, Fibroblasten, Myoblasten und neuronale Vorläuferzellen (Pittenger et al. 1999; Sethe et al. 2006; Valtieri and Sorrentino 2008). Die Differenzierung wird durch Wachstumsfaktoren, bestimmte Signalwege und Transkriptionsfaktoren reguliert, und kann zumindest für die osteogene, adipogene, chondrogene, myogene und neurale Richtung in-vitro nachgestellt werden (Chamberlain et al. 2007; Valtieri and Sorrentino 2008). Für die Differenzierung in die osteogene Richtung sind z.B. die Transkriptionsfaktoren RUNX2 (runt-related transcription factor 2), DLX5 (distal-less homeobox 5) und Osterix/SP7 (Sp7 transcription factor) entscheidend (Karsenty and Wagner 2002; Nakashima et al. 2002). Wie Stammzellen den Weg der Differenzierung einschlagen, wird mehr und mehr auch mit dem Mechanismus der RNA-Interferenz (siehe 3.2.3.5) in Zusammenhang gebracht. Es häufen sich Hinweise darauf, dass verschiedene Stammzelltypen – darunter auch MSC – ihren Stammzellcharakter und ihre Plastizität mittels microRNA (miRNA) aufrechterhalten. Differenzierte MSC weisen ein anderes Muster an miRNAs auf als nicht-differenzierte Vorläuferzellen (Valtieri and Sorrentino 2008) Adulte Stammzellen werden nach den neuesten Befunden als quieszente Zellen mit sehr geringer Proliferationsaktivität beschrieben, die in geringer Anzahl in sogenannten Stammzellnischen vorkommen. Stammzellnischen bestehen entweder aus Stammzellen von nur einem Typ (homogen) oder mehrerer, unterschiedlicher Zelltypen (heterogen), sowie somatischen Zellen. Adulte Stammzellen teilen sich entweder symmetrisch oder asymmetrisch, letzteres führt zu einer gemischten Zellpopulation, da nach der Zellteilung statt zweier Stammzellen nur eine Stammzelle und eine differenzierte Vorläuferzelle entstehen (Fuchs et al. 2004; Jakob et al. 2008). Die Nische der MSC wurde bisher noch nicht identifiziert, es ist nur bekannt, dass MSC zusammen mit Osteoblasten Bestandteile der hämatopoetischen Stammzellnische im Knochenmark darstellen (Kassem and Abdallah 2008). Zumindest in dieser heterogenen Nische scheinen MSC asymmetrische Teilung durchzuführen. Des Weiteren ist auch unklar, ob sich die MSC-Nischen aus verschiedenen Regionen in Aufbau und Zusammensetzung ähneln. Damit MSC in-vivo aus der Quieszenz zur Selbsterneuerung oder zur Differenzierung heraustreten können, sind nicht nur die oben erwähnten intrinsischen Faktoren, sondern auch Extrinsische nötig. Diese stammen u.a. von den somatischen Zellen der Nische und bestehen einerseits aus direkten Zell-Zell-Kontakten und anderseits aus der Sekretion von Wachstums- und anderen löslichen Faktoren, Zytokinen oder Matrixproteinen. Der Zustand der MSC wird jedoch auch von vielen anderen, im Knochenmark residierenden Zellarten beeinflusst, darunter auch von Osteoblasten (Kuhn and Tuan 2010). Telomerase-Aktivität – ebenfalls ein Zeichen für Stemness – konnte in den meisten Untersuchungen nicht nachgewiesen werden, bleibt aber dennoch umstritten. Eine Publikation postuliert, dass humane MSC positiv für STRO1brightVCAM+ aktive Telomerase aufweisen (Gronthos et al. 2003). Es wird jedoch angenommen, dass nur eine primitive Subpopulation an hMSC Telomerase in-vivo exprimiert. Nach Isolierung und Kultivierung von hMSC verlieren die Zellen Teile ihres Stammzellcharakters und die Telomeraseaktivität wird ausgeschalten (Sethe et al. 2006; Bellantuono et al. 2009). 7

Einleitung MSC können im Falle von Verletzungen und zur Geweberegeneration per Chemotaxis über große Distanzen an den Ort des Geschehens rekrutiert werden. Sie migrieren zu Blutgefäßen und zirkulieren in geringer Anzahl im Blutkreislauf. Dies konnte im Fall von Myokardinfarkten (Zhang et al. 2007) und zur Frakturheilung (Shirley et al. 2005) nachgewiesen werden. Für die Migration wurden bisher verschiedene Mediatoren beschrieben: BMP2 und 4, PDGF, S1P, CYR61 (cysteine-rich, angiogenic inducer, 61) und WISP3 (WNT1 inducible signaling pathway protein 3) (Jakob et al. 2008; Pederson et al. 2008). Die Überwindung der endothelialen Barriere wird u.a. mittels Metallopeptidasen (MMP) und deren Regulatoren mediiert; MMP1 und 14, sowie TIMP2 (TIMP metallopeptidase inhibitor 2) spielen eine entscheidende Rolle (Ries et al. 2007). Charakteristisch für MSC in-vitro sind ihre Plastik-Adherenz, ihre Fibroblasten-ähnliche Morphologie und die Eigenschaft, Kolonien (CFU, colony forming units) zu bilden, wenn sie vereinzelt ausgesät werden. Diese CFU bestehen einerseits aus schnell proliferierenden, spindelförmigen Zellen (RSZellen) und weniger schnell differenzierenden, größeren Zellen (Colter et al. 2001). Einige Oberflächenmarker für MSC, die einzeln jedoch nicht ausschließlich in MSC vorkommen, sind STRO1 (Stromal cell-derived factor-1alpha), CD146/MCAM (melanoma cell adhesion molecule), CD106/VCAM (vascular cell adhesion molecule 1), BMPR1A (bone morphogenetic protein receptor, type 1A) und CD73/NT5E (5'-nucleotidase, ecto). MSC sind auch gekennzeichnet durch das Fehlen von Endothelmarkern, wie z.B. CD35/CR1 (complement component (3b/4b) receptor 1) und hämatopoetischen Markern, wie z.B. CD45/PTPRC (protein tyrosine phosphatase, receptor type, C) (Sethe et al. 2006; Sacchetti et al. 2007; Valtieri and Sorrentino 2008). MSC stellen eine vielversprechende Ressource für Zelltherapieansätze dar, da sie multipotent und einfach zu kultivieren sind. Obwohl in-vitro ausführlich studiert, ist das Wissen über MSC in-vivo jedoch noch immer lückenhaft. Dennoch wurden erfolgreich Heilungsstudien am muskuloskelletären System mit applizierten MSC im Tierversuch (Bruder et al. 1998) durchgeführt und bereits vielfach auf den Menschen übertragen (Panetta et al. 2009). Die Multipotenz der Zellen konnte auch durch Transplantation in Myokardium, Gehirn oder sogar in Föten unter Beweis gestellt werden. Die Zellen differenzierten zu Muskelzellen, Nervenzellen bzw. einer Vielzahl von mesenchymalen Zellen im Falle der fötalen Applikation (Chamberlain et al. 2007). Für die Weiterführung und Weiterentwicklung von Zelltherapiemaßnahmen im Menschen stellt sich jedoch die Frage, ob das Alter der Zellen bzw. des spendenden Patienten einen negativen Einfluss auf den Erfolg der Transplantation und die Differenzierungskapazität nehmen kann.

3.1.3

Steuerung des Knochenumbaus 3.1.3.1

WNT-Signalweg

Für die Knochenformation ist das Signalisieren über den kanonischen WNT-Signalweg von entscheidender Bedeutung. WNT (wingless-type MMTV integration site family) sind eine Familie von sezernierten Glykoproteinen, die über Bindung an die Transmembranrezeptoren FZD (frizzled homolog) und anschließender Rekrutierung der transmembranen Corezeptoren LRP5 (low density lipoprotein receptor-related protein 5) oder LRP6 eine Signalkaskade auslösen. Über das Protein DVL (dishevelled) wird der Komplex aus GSK3 (glycogen synthase kinase 3), APC (adenomatous polyposis coli) und Axin in der Zelle aufgelöst, wodurch β-Catenin (von dem Gen CTNNB1 kodiert) nicht mehr phosphoryliert, und dadurch auch nicht mehr in den Proteasomen degradiert wird. Das hypophosphorylierte β-Catenin wird in den Zellkern transloziert und löst dort unter Komplexbildung mit den Transkriptionsfaktoren TCF (T-cell specific transcription factor) und LEF (lymphoid-enhancer binding factor) die Transkription von Zielgenen – u.a. ALPL (Rawadi et al. 2003) – aus (Piters et al. 2008; ten Dijke et al. 2008). Die Bedeutung dieses Signalweges für den Knochen verdeutlicht die knochenspezifische Überexpression von WNT10A, die über Stimulation der Osteoblastogenese zu einer erhöhten Knochenmasse führt (Bennett et al. 2007). Störungen im WNT-Signalweg führen zu reduzierter Knochenmasse, wie beim Osteoporose-Pseudoglioma Sydrom des Menschen, eine 8

Einleitung automosmal rezessive Krankheit, bedingt durch heterozygoten Funktionsverlust von LRP5 (Kato et al. 2002). Der kanonische WNT-Signalweg wird über lösliche Inhibitoren reguliert. WNT als Ligand kann durch WIF1 (WNT inhibitory factor 1) und SFRP (secreted frizzled-related protein) abgefangen werden, wodurch die Bindung an FZD verhindert wird. Sezernierte DKK1 (dickkopf homolog 1) und DKK2 Proteine können an die Corezeptoren LRP5 und 6 binden, wodurch sie den WNT-Signalweg ebenfalls blockieren. Eine Komplexbildung aus DKK, LRP5 oder 6 und dem Transmembranproteinen KRM1 (kremen 1) oder KRM2 wurde ebenfalls als hemmend beschrieben (Piters et al. 2008). Knochenspezifische Überexpression von KRM2 führt im Mausmodell zu schwerer Osteoporose (Schulze et al. 2010). Durch Bindung und Blockierung von LRP5 und LRP6 stellt auch Sclerostin einen Inhibitor des WNT-Signalweges und damit der Knochenformation dar (Li et al. 2005b). OsteocalcinPromoter getriebene, knochenspezifische Überexpression von SOST führte im Mausmodell zu einer reduzierten Knochendichte aufgrund reduzierter Osteoblastenaktivität (Winkler et al. 2003). Sclerostin wurde beschrieben als Inhibitor der Differenzierung von MSC zu Osteoblasten (ten Dijke et al. 2008) und als Störfaktor der Osteoblasten-Aktivität (Winkler et al. 2003). Tiere, die mit einem neutralisierenden Antikörper (Scl-AbI) gegen Sclerostin behandelt wurden, zeigten wiederum einen signifikanten Anstieg der Knochendichte (Veverka et al. 2009). Es wird angenommen, dass nicht nur der kanonische WNT-Signalweg sondern auch nicht-kanonische WNT-Signalgebung bei der Knochenformation eine Rolle spielt. Dazu gehört zum einen der Kalziumabhängige WNT-Signalweg, bei dem die Transkription von Zielgenen durch die intrazelluläre Freisetzung von Kalzium über CAMK2 (calcium/calmodulin-dependent protein kinase), PKC (protein kinase C) und Calcineurin (CABIN1; calcineurin binding protein 1) verläuft. In MSC können auf diesem Weg die Expression von RUNX2 und die gleichzeitige Hemmung der PPARG (peroxisome proliferatoractivated receptor gamma)-Expression angeregt werden. Dies führt zur osteogenen, statt adipogenen Differenzierung der Zellen (Takada et al. 2007). Der zweite β-Catenin-unabhängige WNTWeg führt über DVL zur Coaktivierung der GTPasen RHO und RAC, wodurch der JNK-Signalweg eingeleitet wird. Es wurde gezeigt, dass nicht-kanonisches WNT5A über ERK und AKT die Apoptose von Präosteoblasten und Osteoblasten verhindert (Almeida et al. 2005). 3.1.3.2

BMP-Signalweg

BMP sind Mitglieder der TGFB (transforming growth factor beta)-Familie und wichtige, autokrine Faktoren für die Osteoblastendifferenzierung und -funktion. Sie binden an die Transmembranrezeptoren BMPR1A, 1B oder 2, die daraufhin Dimere bilden und eine Signalkaskade einleiten (Canalis 2009). Diese Kaskade endet in der Aktivierung von Mitgliedern der SMAD-Familie oder führt zur Einleitung von MAPK-ERK-Signalwegen (Miyazono 1999). Über die Phosphorylierung der SMAD1, 5 und 8 werden diese Proteine in den Zellkern transloziert, bilden Komplexe mit SMAD4 und leiten die Transkription von Zielgenen ein. BMP regen die Expression von TNSALP für die Mineralisierung (Rawadi et al. 2003), aber auch RANKL und CSF1 an, wodurch die Osteoklastogenese eingeleitet wird. Sie fördern ebenfalls die Expression von Osteoprotegerin, wodurch die Osteoklastenbildung kontrolliert wird. Die Regulation des BMP-Signalweges erfolgt über BMP-bindende, lösliche Antagonisten, deren Synthese über einen Rückkopplungsmechanismus von BMP selbst ausgelöst wird. Zwei dieser Antagonisten, Noggin (NOG) und Gremlin (GREM) führen bei knochenspezifischer Überexpression zu Osteopenie und hohem Frakturrisiko (Canalis 2009) u.a durch Inhibition der TNSALP-Aktivität (Rawadi et al. 2003). Sclerostin ist ebenfalls ein Antagonist des BMP-Signalweges mit ähnlichen Funktionen, wie Noggin. Es ist umstritten, ob Sclerostin die negativen Veränderungen im Knochenstoffwechsel tatsächlich über den BMP-Signalweg durchführt und nicht ausschließlich über WNT-Hemmung. Das Protein ist ein Antagonist zu BMP, jedoch wurden in einigen Zelltypen keinerlei Auswirkungen auf den BMP-Signalweg registriert. Es konnte gezeigt werden, dass Sclerostin auch eine große Affinität zu Noggin aufweist, und nach Komplexbildung die inhibierende Wirkung auf den BMP-Signalweg aufgehoben wird (Winkler et al. 2004). Einige Arbeitsgruppen vermuten einen 9

Einleitung Zusammenhang zwischen BMP-Signalweg und WNT-Signalweg (ten Dijke et al. 2008), vermutlich über eine autokrine Schleife (Rawadi et al. 2003). 3.1.3.3

Wachstumsfaktoren 3.1.3.3.1

FGF

FGF (fibroblast growth factors) kontrollieren die Proliferation und Differenzierung von vielen verschiedenen Zelltypen. Bisher sind 23 verschiedene Polypeptide dieser Familie bekannt, wobei FGF2 das am ausführlichsten Charakterisierte ist. FGF können in variierender Affinität und unterstützt durch den Co-Liganden Heparansulfatproteoglykan an 4 verschiedene Rezeptoren binden: FGFR1, 2, 3 oder 4, wobei von den ersten drei Rezeptoren Splicevarianten bekannt sind: IIIb und IIIc. Nach Bindung eines Liganden dimerisieren die membranständigen Rezeptortyrosinkinasen und die Signaltransduktion in der Zelle wird über Autophosphorylierung eingeleitet (Marie et al. 2002). In MSC und Osteoblasten werden nur FGFR1 und 2 exprimiert (Miraoui et al. 2009; Hamidouche et al.). Neueste Befunde zeigen, dass FGFR3 nicht nur eine Rolle bei der Chondrogenese zukommt, sondern ebenfalls in MSC exprimiert wird (Lavery et al. 2009). Ein Knock-down von FGFR2(IIIc) führt in Mäusen zu einer reduzierten Expression von RUNX2 und einer retardierten Ossifikation der Röhrenknochen (Eswarakumar et al. 2002). FGFR2 stellt somit einen bedeutenden Faktor für die Osteoblastenproliferation und der Osteogenese dar. Über FGF18 fördern FGFR1 und FGFR2 auch die Mineralisierung. MSC mit Knock-down in einem der beiden Rezeptoren weisen nach osteogener Differenzierung in-vitro geringere Expression von Osteoblastenmarkern auf als die Kontrollzellen (Hamidouche et al. 2010). Die FGF-mediierte Signaltransduktion interagiert mit vielen anderen Wachstumsfaktor-Kaskaden, wie z.B. TGFB und IGF. Eine positive Interaktion mit dem BMP-Signalweg ist ebenfalls in Knochenzellen detektiert worden (Marie et al. 2002). FGF23 stellt eine Besonderheit in der großen Familie der FGF dar, indem es als Hormon agiert, das in Knochen gebildet und zusammen mit dem Rezeptor Klotho den Phosphat- und Kalziumhaushalt des Körpers über die Phosphatrückresorption in der Niere und über den Vitamin D3-Metabolismus reguliert (siehe 3.1.3.5.2 und 3.2.3.6) (Drueke and Prie 2007). Durch die Bindung des sekretorischen Proteins Klotho an FGFR1(IIIc) wird dieser in einen spezifischen Rezeptor für FGF23 umwandelt und die Signaltransduktion eingeleitet (Razzaque and Lanske, 2006; Razzaque et al., 2006). 3.1.3.3.2

IGF

IGF1 und 2 (insulin-like growth factors) sind die häufigsten Wachstumsfaktoren im muskuloskelettalen System. Sie signalisieren über transmembrane Rezeptoren: IGF1 dient als Ligand für IGF1R, während IGF2 an die Rezeptoren IGF1R, IGF2R und IRA (insulin receptor alpha) binden kann (Gicquel and Le Bouc 2006). Lokal wird die Verfügbarkeit und Aktivität von IGF1 und 2 durch Bindung an 6 verschiedene IGFBP (insulin-like growth factor binding proteins) reguliert. Die Bindung dient dem Transport der Proteine und verhindert das Andocken an einen IGF-Rezeptor. Die Inaktivierung von IGF1, IGF2 oder IGF1R im Mausmodell führte zu reduzierter Chondrozytenproliferation und -differenzierung. IGF1 spielt jedoch auch im Knochen eine wichtige Rolle, indem es über COL1 die Osteoblastenfunktion und Knochenformation anregt. Des Weiteren stimuliert das Protein die RANKL-Expression, wodurch die Osteoklastogenese gefördert wird. Die IGF1-Expression in Osteoblasten wird durch PTH (parathyroid hormone) angeregt, dient aber in Rückkopplungsreaktionen auch als Regulator des PTH-Katabolismus (siehe 3.1.3.5.1) (Canalis 2009). IGF2 fördert zum einen ebenfalls die Osteoklastenbildung (Nakao et al. 2009), unterstützt jedoch zum anderen auch die osteogene Differenzierung von MSC über die Interaktion mit BMP9 (Chen et al. 2010). Die Bindeproteine der IGF sind ebenfalls von Bedeutung für die Knochenformation. Überexpression von IGFBP2 und IGFBP5 inhibiert die Osteoblastenfunktion durch Hemmung des IGF1-Signalweges. 10

Einleitung Mäuse mit knochenspezifischer Überexpression von IGFBP4 oder 5 weisen reduzierte Knochenformation und daraus resultierende Osteopenie auf (Canalis 2009). 3.1.3.3.3

TGFB

Von TGFB (transforming growth factor beta) wurden bislang 3 verschiedene Proteine in Säugern detektiert: TGFB1, 2 und 3, die alle, wie BMP, zur TGFB-Superfamilie gehören. TGFB werden als inaktive Vorläufer von den Zellen synthetisiert. Nach Sezernierung binden sie an LTBP (latent transforming growth factor beta binding protein), Proteine, die in der extrazellulären Matrix – so auch in der Knochenmatrix – lokalisiert sind, und zur Lagerung von TGFB dienen. Das noch immer inaktive TGFB kann durch proteolytische Spaltung mittels Integrin, Plasmin oder Thrombin, oder durch Konformationsänderungen aktiviert werden (ten Dijke and Arthur 2007; Yan et al. 2009). TGFB bindet als Homodimer an den membrangebundenen Rezeptor TGFBR1 wodurch dieser ein Dimer mit dem konstitutiv aktiven TGFBR2-Rezeptor bildet und dadurch die Signalkaskade in der Zelle einleitet (Yan et al. 2009). Die Expression der beiden Rezeptoren, sowie aller drei TGFB-Proteine konnte in Osteoblasten, als auch Osteoklasten nachgewiesen werden (Fox and Lovibond 2005). TGFB1 ist eines der häufigsten im Knochen vorkommenden und am besten untersuchten TGFB-Proteine. TGFB1 fördert die Migration von MSC (Tang et al. 2009) und Präosteoblasten, sowie deren Proliferation und frühe osteogene Differenzierung. Späte Phasen der Osteoblastendifferenzierung und Knochenmatrixbildung werden jedoch gehemmt (Janssens et al. 2005). TGFB wirkt auch stimulierend auf die Fusion von haematopoetischen Stammzellen und Monozyten zu Osteozyten. Die gleichzeitige Stimulation der Osteoblastendifferenzierung und OsteoprotegrinExpression trägt dazu bei, dass die Knochenresorption durch Osteoklastogenese nicht überhandnimmt und der Knochenumbau im Gleichgewicht bleibt (Fox and Lovibond 2005). 3.1.3.3.4

PDGF

PDGF (platelet-derived growth factors) spielen nicht nur eine Rolle im vaskulären System und bei der Wundheilung, sondern werden auch von Makrophagen, Osteoblasten und Fibroblasten exprimiert und sezerniert. PDGF bestehen zum größten Teil aus Homodimeren, die von den vier verschiedenen PDGF-Ketten – PDGFA, B, C und D – gebildet werden. Sie wirken nach Bindung an die membranständigen Tyrosinkinaserezeptoren PDGFR als Mitogene, u.a. in Zellen der Osteoblastenlinie und in Osteoklasten (Graham et al. 2009a). Diese vermutlich autokrine Signaltransduktion trägt jedoch nicht dazu bei, die Differenzierung dieser Zellen zu fördern (Tanaka and Liang 1995; Canalis 2009). Bei der Frakturheilung wird PDGF in der initialen Phase aus dem Frakturhämatom freigesetzt und leitet auch hier die Heilung ein (Weiss et al. 2009). Zum Beispiel konnte gezeigt werden, dass PDGFAA und BB die Bildung von COL1, und damit den Aufbau der Knochenmatrix fördern, die Differenzierung von MSC in die osteogene Richtung jedoch stören können, u.a. durch Inhibition von IGF1 (Tanaka and Liang 1995; Graham et al. 2009a). 3.1.3.3.5

EGF

Zur Familie der EGF (epidermal growth factor) gehören 6 verschiedene Proteine, unter anderem EGF, TGFA (Transforming growth factor alpha) und HBEGF (heparin binding epidermal growth factor), die alle Liganden für den Rezeptor EGFR darstellen. Der Rezeptor wird erst nach Dimerisierung mit einem von 3 verwandten Rezeptoren – ERBB2, 3 oder 4 (v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2, neuro/glioblastoma derived oncogene homolog) – aktiviert. HBEGF bindet auch direkt an ERBB4 (Xian 2007). In-vitro-Supplementation mit einem dieser drei Wachstumsfaktoren führt in Osteoblasten und Präosteoblasten zur Stimulation der Proliferation und Inhibition der 11

Einleitung Differenzierung (Chien et al. 2000). In MSC konnte hingegen durch EGF keine Störung der osteogenen Differenzierung nachgewiesen werden, obwohl gleichzeitig die Proliferation und Migration dieser Zellen angeregt wurde. Eine Vernetzung mit dem PTH-Signalweg wurde in Osteoblasten nachgewiesen: PTH fördert die Expression von EGF, HBEGF und TGFA. Auch für die Osteoklastogene ist der EGF-Signalweg von Bedeutung, denn er fördert die Proliferation und Migration der Zellen (Schneider et al. 2009). Die Bedeutung der EGF-Signalgebung wird deutlich in EGFR-/- Mäuse, die aufgrund von Funktionsstörungen verschiedener Organe nicht lebensfähig sind und kurz nach der Geburt sterben. Der Knochen dieser Tiere ist ebenfalls stark beeinträchtig. Die Embryonen sind gekennzeichnet durch verzögerte enchondrale Ossifikation, sowie verlangsamte Rekrutierung der Osteoblasten und Osteoklasten (Wang et al. 2004). 3.1.3.3.6

VEGF

Die proangiogene Familie der VEGF besteht aus VEGFA (vascular endothelial growth factor alpha), B, C, D, E, F und PLGF (placental growth factor). Sie wirken als Mitogene über die Rezeptortyrosinkinasen VEGFR1, 2 und 3, sowie die Corezeptoren Heparansulfatproteoglykan, NRP1 und 2 (neuropilin). VEGF-Signalwege sind entscheidend für die enchondrale Ossifikation während der Entwicklung und für die Angiogenese. Der am ausführlichsten studierte Faktor VEGFA bindet an VEGFR1 von Osteoklasten und regt die Proliferation, Differenzierung und Migration an. Durch Knochenresorption wird wiederum die Angiogenese stimuliert, und neu gebildeter Kochen mit Blutgefäßen versorgt. VEGFA dient auch als Chemoattraktant für Osteoblasten und fördert ebenfalls deren Differenzierung und Proliferation, z.T. über den BMP-Signalweg. Die widersprüchlichen Funktionen des Proteins dienen dem Ausgleich zwischen Knochenresorption und Knochenaufbau (Dai and Rabie 2007). 3.1.3.4

Mechanotransduktion

Klinische Untersuchungen an Astronauten nach längerem Aufenthalt unter Mikrogravitation und der Auswirkungen von Bewegung auf die Knochendichte postmenopausaler Frauen zeigten, dass fehlende Beanspruchung der Knochen zu einer progressiven Abnahme der Knochendichte führt (Galli et al. 2010). Die mechanosensitiven Zellen des Knochens, die als Antwort auf Beanspruchung Knochenumbauvorgänge einleiten, sind u. a. die in der Matrix eingeschlossenen Osteozyten. Zum einen führt alltägliche Beanspruchung zu Mikroschäden im Kochen, die von den Osteozyten registriert werden, zur Apoptose der Zellen führen und dadurch die Knochenresorption einleiten (Verborgt et al. 2002; Tatsumi et al. 2007). Zum andern führt Knochenbeanspruchung zur Bewegung der Flüssigkeiten in den Kanaliculi, durch die die Osteozyten über dendritenartige Ausläufer miteinander in Kontakt stehen. Flüssigkeitsscherstress wird von Transmembranrezeptoren der Osteozyten – wie z.B. CD44 oder Integrinen – wahrgenommen und in das Zellinnere weitergeleitet. Dort wird die Expression von mechanosensitiven Genen angeregt. Die Produktion von COX2 (PTGS2), sowie die Segretion von Prostaglandin E2 und NO (Stickstoffmonoxid) wird erhöht, wodurch der Anabolismus des Knochens aufrechterhalten wird (Klein-Nulend et al. 2005; Galli et al. 2010). Es wurde auch gezeigt, dass Mechanotransduktion zu einer verringerten Expression von Sclerostin führt (Robling et al. 2006). Aber auch andere Zellen des Knochens reagieren auf mechanische Beanspruchung, wie z.B. MSC und Osteoblasten (Klein-Nulend et al. 2002).

Einleitung 3.1.3.5

Hormonelle Steuerung 3.1.3.5.1

PTH und PTHLH

PTH (parathyroid hormone) und PTHLH (parathyroid like hormone) sind Hormone, die beide trotz geringer Sequenzhomologie (16%) an den Rezeptor PTH1R binden. Der transmembrane PTHR1 wird in Osteoblasten exprimiert, und die Aktivierung des Rezeptors führt u. a. zur Einleitung der Transkription von MMP13, das den Knochenumbau fördert, sowie von EFNB2. PTH ist ein Hormon der Nebenschilddrüsen und wirkt somit endokrin auf den Knochenmetabolismus. PTHLH hingegen wird von vielen verschiedenen Gewebearten produziert und sezerniert, wie z.B. Haut, Blutgefäßen, Knochen, Niere, etc. Es wirkt entweder autokrin oder parakrin auf die Zielzellen (Datta and AbouSamra 2009). Die knochenanabole Wirkung von PTHLH und PTH kann unter anderem über deren Einfluss auf den WNT-Signalweg induziert werden. Es wurde gezeigt, dass beide Hormone die Expression von SOST in PTH1R-exprimierenden Osteozyten (Bellido 2006) unterdrücken. Die Signalgebung durch PTH und PTHLH im Knochen wirkt sich abhängig von der Dauer der Einwirkung auf die mesenchymalen Zielzellen entweder anabol oder katabol aus. Intermittierende Gabe von PTH resultiert in erhöhter Knochenformation aufgrund der Erhöhung der Osteoblastenanzahl (Datta and Abou-Samra 2009). Die endokrine Produktion von PTH wird durch Kalziummangel ausgelöst und steht im engen Zusammenhang mit dem Vitamin D3-Metabolismus (siehe 3.1.3.5.2). Sie dient zur Aufrechterhaltung des ausgewogenen Mineralhaushaltes des Körpers, und regt zu diesem Zweck die Mobilisierung von Kalzium und Phosphat u.a. aus dem Knochen an (Quarles 2008). Kontinuierliche Gabe von PTH oder PTHLH führt jedoch zur Induktion der Knochenresorption durch Osteoklasten, deren Bildung wiederum von aktiven Osteoblasten durch Expression von RANKL angeregt wird. Gleichzeitig wird die Expression von Osteoprotegerin, TNSALP, COL1A und den Osteoblastenmakern Osteopontin (SSP1) und Osteonectin (SPARC) gehemmt (Sims and Gooi 2008; Datta and Abou-Samra 2009). Neueste Forschungsergebnisse deuten auch auf die Expression von PTH1R in Osteoklasten und damit auf eine direkte Kontrolle der Osteoklastogenese hin (Dempster et al. 2005). 3.1.3.5.2

Vitamin D3

Vitamin D3 wird in der Haut durch UV-Bestrahlung aus 7-Dehydrocholesterin über Prävitamin D3 synthetisiert oder über die Nahrung aufgenommen. Bevor es aktiv im Körper wirken kann, muss es durch Monooxygenasen hydroxyliert werden. Zu diesem Zweck wird Vitamin D3, gebunden an DBP (vitamin D binding protein) über den Blutkreislauf zur Leber transportiert und dort durch 25Hydroxylase (CYP2R1) zu 25-(OH)D3 (25-Hydroxyvitamin D3) hydroxyliert. Das inaktive 25-(OH)D3 wird erneut mittels DBP zur Niere transportiert und mit Hilfe des Enzyms 1-α-Hydroxylase (CYP27B1) in aktives 1,25-(OH)2D3 (1,25-Dihydroxyvitamin D3) umgewandelt. 1,25-(OH)2D3 regt die KalziumResorption im Darm an und fördert dadurch indirekt die Mineralisierung des Knochens (Ebert et al. 2006a; St-Arnaud 2008). Über den Vitamin D-Rezeptor VDR löst 1,25-(OH)2D3 die Expression von Zielgenen aus, u.a. von TNSALP (Orimo 2010) und 24-Hydroxylase (CYP24A1), die 1,25-(OH)2D3 in weniger aktive Metabolite degradiert (Holick and DeLuca 1974). Die auf diesem Weg regulierte 1,25-(OH)2D3-Produktion dient zur Aufrechterhaltung des Phosphat- und Kalziumspiegels des Organismus und ist gekoppelt an den PTH-Metabolismus. Als Antwort auf Hypokalzämie und Vitamin D3-Mangel erhöht die Nebenschilddrüse die Ausschüttung von PTH und aktiviert somit die renale 1-α-Hydroxylase. Dies führt zur Erhöhung des 1,25-(OH)2D3-Spiegels, wodurch die Kalzium- und Phosphatresorption im Dünndarm, aber auch im Knochen durch Osteoklasten angeregt wird (Rizzoli et al. 1977; Fukumoto et al. 2008). Es kommt zudem zu einem Rückkopplungseffekt, indem 1,25-(OH)2D3 wiederum die PTHAusschüttung in den Nebenschilddrüsen hemmt (Brown et al. 2006).

Einleitung Vitamin D3 Mangel kann zur Osteomalazie oder Rachitis führen, entweder aufgrund von zu geringer Bestrahlung mit Sonnenlicht, entzündlichen Darmerkrankungen, oder aufgrund von genetischen Defekten (Lips 2006). In Präosteoblasten führte die Stimulation mit 1,25-(OH)2D3 in frühen Passagen zu einer verminderten Transkription von COL1 und ALPL, während die Expression dieser Gene in späteren Passagen anstieg. Es wird ein pleiotroper Effekt von 1,25-(OH)2D3 auf die Zellen vermutet, der abhängig davon ist, in welchem Stadium sich diese befinden bzw. wie viele Populationsverdopplungen die Zellen bereits durchlaufen haben (St-Arnaud 2008). Der Vitamin D3-Metabolismus kann u.a. durch die Wirkung von FGF23 und Klotho reguliert werden, da sie die Expression der 1α-Hydroxylase unterdrücken (Razzaque and Lanske, 2006; Razzaque et al., 2006). Klotho- oder FGF23-Defizienz führt über erhöhte 1,25-(OH)2D3-Konzentration u.a. zu einem hohen Phosphatspiegel und Alterungserscheinungen (siehe auch 3.2.3.6) (Kuro-o et al. 1997; Shimada et al. 2004; Drueke and Prie 2007). 3.1.3.5.3

Sexualhormone

Androgene und Östrogene sind Steroidhormone, die entscheidend zur Knochenentwicklung beitragen. Sie unterstützen die Knochenformation und hemmen die Knochenresorption. Wenn auch in unterschiedlichen Konzentrationen werden beide Steroide in beiden Geschlechtern synthetisiert. Androgene werden in Männern von den Testes, sowie zusätzlich – genau wie bei Frauen – in der Nebenniere produziert. Testosteron ist das wichtigste Androgen der Männer und wirkt entweder direkt, oder nach Umwandlung in die aktivere Form 5α-Dihydrotestosteron durch eine 5α-Reduktase (SRD5A) auf den spezifischen Androgenrezeptor AR. Testosteron wird jedoch über die P450Aromatase (CYP19A1) auch in Östradiol – das klassische weibliche Steroidhormon – umgewandelt und wirkt dann als Ligand für die Östrogenrezeptoren ESR1/ERα und ESR2/ERβ. Beide Enzyme werden auch bei beiden Geschlechtern im Knochen exprimiert und lassen darauf schließen, dass die Östradiol- und Testosteronbildung zumindest bei Männern direkt im Zielgewebe von statten geht. In Frauen werden große Mengen an P450-Aromatase in den Ovarien produziert und dort die Reaktion zur Bildung von Östrogenen aus Vorstufen und Androgenen katalysiert. Der Hauptteil des Östradiols wird von den Ovarien sezerniert und gelangt über den Blutkreislauf in die Zielgewebe (Venken et al. 2008). ESR1, ESR2 und AR werden in Osteoblasten, Osteoklasten, MSC und Osteozyten exprimiert, wodurch anzunehmen ist, dass die Sexualhormone im Knochen direkt über ihre Rezeptoren wirken und dort die Expression entsprechender Zielgene anregen (Riggs et al. 2000; Vanderschueren et al. 2004). Unter anderem in MSC konnte ein weiterer Rezeptor für Östradiol identifiziert werden – GPER – der als membranständiger Rezeptor die Signalwirkung über Signaltransduktion schneller vermittelt als die Steroidhormonrezeptoren (Jenei-Lanzl et al.). Aktiver GPER aktiviert über verschiedene Signalmoleküle u. a. EGFR durch Phosphorylierung des zytoplasmatischen Proteinschwanzes des Rezeptors (Filardo 2002). Die antiresorptive Wirkung von Östrogenen wird über die verringerte Expression von Zytokinen, wie z.B. IL1, TNF (tumor necrosis factor) und IL6, in benachbarten Osteoblasten, Monozyten und MSC eingeleitet (Riggs et al. 2000). Des Weiteren fördert Östradiol die Apoptose von Osteoklasten, sowie Expression von Osteoprotegerin, und verringert die Expression von RANKL in Osteoblasten. Androgene reduzieren Osteoklastogenese ebenfalls über erhöhte Osteoprotegerin-Synthese. Beide Sexualhormone haben auch positiven Einfluss auf die Osteoblastendifferenzierung, -funktion und proliferation (Venken et al. 2008). Da Sexualhormone den Knochenumbau hemmen, führt Defizienz in beiden Geschlechtern zu hohem Knochenumsatz, indem die Anzahl der Osteoklasten, paradoxerweise aber auch der Osteoblasten steigt (Riggs et al. 2002).

Einleitung

3.2 Alterung 3.2.1

Alterung des Organismus

Alterung ist ein komplexer, biologischer Prozess, der zu verminderter Funktion der Organe und letztendlich zum Organversagen führt. Während der Alterung des Körpers reduziert sich dessen Fähigkeit auf Stress zu reagieren bzw. Krankheiten/Infektionen abzuwehren. Alters-assoziierte Krankheiten, wie Arteriosklerose, Muskelschwund (Sarkopenie), Osteoporose oder degenerative Krankheiten des Zentralen Nervensystems häufen sich mit der Anzahl an Lebensjahren des Menschen (Mimeault and Batra 2009; Sahin and Depinho). Das Risiko zur Entstehung von Tumoren nimmt ebenfalls zu (Mimeault and Batra 2009). Letztendlich kann Alterung als Rückgang der physiologischen Funktionen, die notwendig für den Erhalt und die Fortpflanzungsfähigkeit des Körpers sind, definiert werden (Kuro-o 2001). Dies lässt sich auf alle Organismen übertragen, von Einzellern bis zu Pflanzen, Mollusken und Eukaryoten (Nystrom 2003; Abele et al. 2009; Austad 2009; Watson and Riha).

3.2.2

Zelluläre Seneszenz

Um die Funktion der Organe zu erhalten, muss das Gewebe kontinuierlich mittels somatischer Stammzellen regeneriert werden (Ho et al. 2005). In-vitro konnte jedoch gezeigt werden, dass diese undifferenzierten, multipotenten Zellen und alle anderen Zellen des adulten Organismus eine limitierte Teilungsfähigkeit aufweisen. Diese Limitation wird replikative bzw. zelluläre Seneszenz genannt, oder unter dem Begriff Hayflick-Limit zusammengefasst. Zellen treten nach einer definierten Anzahl an Zellteilungen – in der Regel ca. 50 Populationsverdopplungen – in einen irreversiblen G1-Arrest des Zellzyklus ein (Hayflick and Moorhead 1961; Hayflick 1965). Seneszente Zellen weisen morphologische Veränderungen auf. Sie sind meist abgeflacht, enthalten viele Granula, und in vielen Zellarten konnte eine erhöhte β-Galaktosidase Aktivität nachgewiesen werden. Die Färbung der Zellen mittels X-Gal-Spaltung ist ein typischer Nachweis für Seneszenz (Dimri et al. 1995). Aufgrund der Alterung der Zellen geht deren Replikationsfähigkeit verloren, des Weiteren weisen sie Veränderungen in ihrer Funktion auf. Dennoch bleiben sie metabolisch aktiv – wenn auch eingeschränkt – und treten über lange Zeiträume hinweg nicht in die Apoptose ein (Cristofalo et al. 2004; Muller 2009). Seneszente Zellen konnten in in-vivo ebenfalls nachgewiesen werden (Campisi 2005). Für die Regeneration von Organen stehen Stammzellen somit nur innerhalb einer begrenzten Zeitspanne zur Verfügung, was letztendlich zur Alterung des gesamten Organismus führen kann. Ausschließlich pluripotente, embryonale Stammzellen und adulte Zellen, die zur Pluripotenz umprogrammiert wurden, weisen eine unbegrenzte Teilungsrate in-vitro auf (Amit et al. 2000; Hochedlinger and Jaenisch 2006). Im Vergleich zu proliferierenden Zellen sind seneszente Zellen durch ein verändertes Expressionsmuster gekennzeichnet. Viele Gene sind zwar weiterhin durch Stimulation mit Mitogenen (z.B. PDGF) induzierbar (Paulsson et al. 1986); Gene zur Förderung der Proliferation werden jedoch reprimiert und antiproliferative Gene erhöht exprimiert. Die bisherigen Erkenntnisse beschreiben mehrere Wege, auf denen der irreversible Zellzyklus-Arrest auf Genexpressionsebene eingeleitet werden kann. Die zwei bekanntesten Wege werden im Folgenden näher beschrieben. Der P16/RB-Signalweg verläuft über die Expression des Gens CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), die proportional zur Anzahl an Populationsverdopplungen der Zellen zunimmt. Das Gen codiert für den Tumorsuppressor P16, ein Inhibitor der Cyclin-abhängigen Kinasen CDK4 und CDK6. Dies führt zur Dephosphorylierung und somit Inaktivierung des Retinoblastoma-Proteins (RB) und letztendlich durch Hemmung von Transkriptionsfaktoren zum Proliferationsstopp (Abb. 4) (Bringold and Serrano 2000). Inaktivierung des P16/RB-Signalwegs führt zu Verlängerung der Lebensspanne von Zellen oder zur Immortalisation (Brenner et al. 1998). Nicht nur in Zelllinien, sondern auch in mehr als 30% von Tumoren konnte eine P16-Inaktivierung gefunden werden (Ruas and Peters 1998). 15

Einleitung

Akkumulation von Zellteilungen/DNASchäden, Stress

BMI

P16

P53 (aktiviert)

CDK4-6/CyclinD

P21

RB Phosphorylierung

CDC2/CyclinB

E2F Aktivierung

G2-Arrest

Apoptose

Transkription

G1-Arrest Abb. 4 Einleitung des Zellzyklusarrestes in G1 bzw. G2 durch P16/RB- bzw. P53/P21-Signalwege. Grafik zusammengestellt nach (Bringold and Serrano 2000; Taylor and Stark 2001; Ohtani et al. 2004).

P53 (TP53, tumor protein p53) wurde in der Hälfte aller bekannten Tumore in inaktiver Form vorgefunden. Im Laufe der Zellalterung – meist aufgrund der Anhäufung von DNA-Schäden – sammelt sich aktives p53 in der Zelle an. Dies kann letztendlich, abhängig vom Zelltyp, entweder zur Seneszenz oder zur Apoptose führen. In die Aktivierung von p53 sind komplexe, post-translationale Modifikationen involviert, inklusive Phosphorylierung und Acetylierung. Wenn p53 als Transkriptionsfaktor für P21 (CDKN1A, cyclin-dependent kinase inhibitor 1A ) wirkt, und dadurch dessen Expression erhöht, erfolgt der reversible oder irreversible Stopp des Zellzyklus in G1 oder G2 Abb. 4) (Bringold and Serrano 2000). Die Beteiligung der genannten Tumorsuppressorgene bei der Initiierung von Seneszenz unterstützt die Theorie, dass Seneszenz eine Gegenmaßnahme zur Entstehung von Tumorzellen darstellt (Campisi 2001). Tumorzellen sind durch unlimitierte Proliferation gekennzeichnet und entstehen durch Akkumulation von Mutationen. Diese treten in mitotisch aktiven Zellen bereitwilliger auf als in sich nicht teilenden Zellen (Busuttil et al. 2006). Die Reaktivierung der Telomerase wird in vielen Tumormodellen im Zusammenwirken mit dem Verlust der P16 und/oder p53 Aktivität als wichtiger Schritt der Tumorigenese gebracht (Newbold 2002). Kontrovers ist die Tatsache, dass die Alterung von Mammalia oft mit der Entstehung von Tumoren einhergeht. Eine mögliche Erklärung stellt die Hypothese dar, dass die Mikroumgebung von Geweben durch Akkumulation von seneszenten Zellen im Alter gestört ist. In Fibroblasten konnte gezeigt werden, dass diese Zellen in seneszentem Zustand Faktoren sezernieren, die das umliegenden Gewebe zerstören oder dessen Proliferation stimulieren (Campisi 2000). Auf diese Art können Mutationen in nicht-seneszenten Nachbarzellen gefördert werden – auch in sich nicht teilenden Zellen (Busuttil et al. 2006) – wodurch das Risiko zur Entstehung von Tumoren erhöht wird.

Einleitung

3.2.3

Ursachen für Alterung 3.2.3.1

Telomere

Telomere sind Nukleoproteinkomplexe aus repetitiven DNA-Sequenzen und spezifischen Bindungsproteinen an den Chromosomenenden (Blackburn 1991). Sie dienen zur Aufrechterhaltung der Chromosomenstabilität, indem sie als Schutzmechanismus gegen den Abbau von kodierenden DNA-Sequenzen während der Replikation fungieren (Hackett et al. 2001). Die DNA-Polymerasen können an den Chromosomenenden nicht mehr am Folgestrang ansetzen, wodurch die Telomere nach jeder Zellteilung verkürzt werden (Levy et al. 1992; Allsopp et al. 1995). Die Telomerase, bestehend aus einer Reversen Transkriptase (TERT) und einer RNA-Komponente (TERC), verhindert die Verkürzung der Telomere. Dabei dient die RNA-Komponente als Template für die de-novo Synthese der Telomer-Sequenz (Nakamura et al. 1997). Im Menschen ist Telomerase nach dem Embryonalstadium ausschließlich in Keimbahnzellen und in Stammzellen von stark regenerativen Geweben, wie z.B. hämatopoetische und neuronale Stammzellen, sowie Stammzellen der Haut und des Darms zu finden. (Forsyth et al. 2002; von Figura et al. 2009). Sobald jedoch die Differenzierung dieser Zellen einsetzt, wird die Telomerase-Aktivität unterdrückt (Sethe et al. 2006). In vielen Tumorzellen wurde sie wieder reaktiviert vorgefunden (Artandi and DePinho). In Nagetieren hingegen konnte die Telomerase in allen Geweben und somatischen Zellen nachgewiesen werden (Prowse and Greider 1995). Die Chromosomenenden von Zellen ohne Telomerase-Funktion verkürzen sich bis zu einer kritischen Länge, ab der DNA-Checkpoints des Zellzyklus einsetzen und die weitere Replikation verhindern, ähnlich wie bei einem DNA-Doppelstrangbruch (siehe 3.2.3.2) (d'Adda di Fagagna et al. 2003). Dadurch kommt es zum P53-vermittelten irreversiblen G1-Arrest oder zur Apoptose, aber auch die Aktivierung des P16/RB-Signalweges konnte nachgewiesen werden (Lee et al. 1998; Jacobs and de Lange 2005; Choudhury et al. 2007). Telomerverkürzungen treten während der humanen Alterung des Menschen bisher in fast allen untersuchten Geweben auf (Djojosubroto et al. 2003; Jiang et al. 2007; von Figura et al. 2009). Dass diese Verkürzungen direkten Einfluss auf die Alterung nehmen, konnte an Terc -/- Mäusen gezeigt werden. In diesen Tieren führt der Verlust der Telomerasefunktion ab der dritten Generation zu reduzierter Stammzellfunktion und einer verkürzten Lebensspanne (Lee et al. 1998; Rudolph et al. 1999). Zellen mit einer transgenen TERT-Expression, weisen hingegen stabilisierte Telomerlängen und damit unlimitiertes, replikatives Potential auf, ohne jedoch zwangsläufig Tumoreigenschaften zu entwickeln, wie z.B. hMSC-TERT (Bodnar et al. 1998; Simonsen et al. 2002). 3.2.3.2

DNA- Reparatur

Die Schädigung von DNA, vor allem durch Doppelstrangbrüche, kann zu Seneszenz, Zelltod oder zur Entwicklung von Tumoren führen (Campisi and d'Adda di Fagagna 2007). Diese Schäden treten entweder spontan auf oder werden durch die Umwelt beeinflusst. Es wird angenommen, dass radioaktive Strahlung, UV-Strahlung, virale Infektion oder Chemikalien nicht nur über Mutationen letztendlich zur Entstehung von Tumoren führen, sondern die betroffenen Zellen alternativ den entgegen gesetzten Weg einschlagen und in die Seneszenz eintreten (Gensler and Bernstein 1981). Der Eintritt in den Zellzyklusarrest wird über den P53/P21-Signalweg eingeleitet, in vielen Zellen jedoch ebenfalls über den P16/RB-Weg (Di Leonardo et al. 1994; Robles and Adami 1998; Beausejour et al. 2003). Meist führen DNA-Schäden zu einem reversiblen Zellzyklus-Stopp, um über Basen- und Nukleotidexzisionsreparatur, Mismatch- oder Doppelstrangbruchreparatur, die bei der Replikation entstandenen Fehler oder DNA-Brüche auszubessern. Während der Alterung nimmt die Effektivität dieser Reparaturmechanismen jedoch ab. In einigen Studien konnte gezeigt werden, dass die Expression der dafür verantwortlichen Reparaturenzyme im Laufe der Alterung sinkt, ebenso die Sensibilität auf DNA-Schäden zu reagieren (Goukassian et al. 2000; Intano et al. 2003; Cabelof et al. 2006; Gorbunova et al. 2007). 17

Einleitung 3.2.3.3

Oxidativer Stress

Akkumulation von Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) führt zu oxidativem Stress, der in Zusammenhang mit Alterung, Carcinogenese und neurodegenerativer, sowie kardiovaskulärer Krankheiten gebracht wird (Harman 1956; Olinski et al. 2007; Gems and Doonan 2009). Diese freien Radikale sind ein Nebenprodukt des Sauerstoffmetabolismus der Zellen, der auf zwei Wegen von statten geht. Sie entstehen durch biochemische Umsetzung von O2 als Substrat – z.B. bei Oxidasekatalysierten Reaktionen – oder bei der Zellatmung in den Mitochondrien, bei der Superoxid Anion frei gesetzt wird (Vanderkooi et al. 1991; Olinski et al. 2007). Es wurde die „Mitochondrial free radical theory of aging“ (MFRTA) aufgestellt, die besagt, dass Alterung allein oder hauptsächlich durch die ROS-Produktion der Mitochondrien vorangetrieben wird (Harman 1972). Um Schäden durch ROS zu vermeiden, werden die freien Radikale von antioxidativen Enzymen abgebaut. Dazu gehören Katalasen, Superoxiddismutasen (SOD), die Selenium-abhängigen Glutathionperoxidasen und Thioredoxinreduktasen (TRX) (Ebert et al. 2006b; Lu and Holmgren 2009). Oxidativer Stress entsteht wenn sich die Konzentration von ROS durch Überproduktion und/oder durch Störungen des antioxidativen Mechanismus erhöht. Dies führt letztendlich zu einem Anstieg an oxidativ modifizierten Makromolekülen, darunter auch DNA (Sohal et al. 2002). Die Akkumulation von oxidativem Schaden während der Alterung ist bewiesen; dass jedoch die Mitochondrien dazu beitragen, wurde widerlegt. Die MFRTA besagt, dass die Mitochondrien während der Zellalterung durch oxidativen Stress in ihrer Funktion eingeschränkt werden, und dies letztendlich zu einer weiteren Erhöhung der mitochondrialen ROS-Produktion führt. (Lapointe and Hekimi 2010). In Tiermodellen konnte jedoch gezeigt werden, dass der Verlust der MitochondrienFunktion nicht zwangsläufig zur Alterung führt. Mclk1+/- Mäuse erreichten sogar längere Lebensspannen als Wildtyp-Tiere, obwohl sie ein hohes Level an oxidativem Stress aufweisen (Lapointe and Hekimi 2008; Lapointe et al. 2009). Mausmodelle heterozygot für Knockdown von antioxidativen Enzymen der Mitochondrien – z.B. Sod2 und Trx2– weisen ebenfalls keine frühzeitige Alterung auf (Jang and Remmen 2009). 3.2.3.4

Proliferationsstress und Mitogene

Mitogene Signale und die Signalkaskaden, die sie auslösen, können den Proliferationsdruck von Zellen soweit erhöhen, dass dies zu Stress und letztendlich ebenfalls zur Seneszenz führen kann. Die Mehrheit der mitogenen, extrazellulären Signale mündet in der Aktivierung der RAS-Signalkaskaden, die Proliferation, Überleben der Zellen, oxidativen Stress und cytoskelettale Veränderungen einleiten können (Malumbres and Pellicer 1998). RAS stellt das am häufigsten aktivierte Onkogen in Tumoren dar (Bringold and Serrano 2000). Ein wichtiger Signalweg, essentiell für die Proliferation, ist die MAPK (mitogen-activated protein kinase)-Kaskade, die über die Aktivierung der Kinasen RAF-MAPK-ERK zur Transkription von Proliferations-fördernden Genen führt. Über RAS wird auch PI3K aktiviert (siehe 3.2.3) (Longo 2004). Es konnte gezeigt werden, dass RAS-Signalkaskaden Seneszenz über den P16/RBoder den P53/P21-Signalweg einleiten (Serrano et al. 1997). In Hefen führte die Deletion des RASOrthologs zur Verlängerung der Lebenspanne, die Überexpression reduzierte hingegen das replikative Potential in Saccharomyces cerevisiae drastisch (Pichova et al. 1997). Dass RAS auch oxidativen Stress einleiten kann, zeigen Versuche an Mammalia-Zelllinien in denen RAS inhibiert wird, und diese Zellen daraufhin eine erhöhte Resistenz und Lebenserwartung nach Serumentzug aufweisen. Des Weiteren wird weniger Superoxid produziert, selbst bei Stimulation mit Wachstumsfaktoren (Rojas et al. 1996; Mills et al. 1998; Longo 2004). Der RAS-Signalweg wird vor allem von aktivierten Rezeptortyrosinkinasen eingeleitet, zu denen zählen u.a. EGFR, FGFR1-4 sowie PDGFA-D. Über zwischengeschaltete Proteine und deren Aktivierung wird letztendlich RAS stimuliert (Eswarakumar et al. 2005; Ramos 2008). Diese Aktivierung der RAS/MAPK -Signalkaskade kann auch von G-gekoppelten Rezeptoren, Integrinen, sowie den intrazellulären Tyrosinkinasen SCR und FYN eingeleitet werden. (Ramos 2008).

Einleitung 3.2.3.5

Epigenetik

Epigenetische Effekte werden im Laufe des Lebens während der DNA-Replikation kontinuierlich auf Tochterzellen übertragen. Mechanismen der Epigenik sind DNA-unabhängig und umfassen DNAMethylierung durch Methyltransferasen (DNMTs), sowie Modifikationen der Histone wie Methylierung, Acetylierung und Phosphorylierung. Aber auch strukturelle Veränderungen des Chromatins und RNA-Interferenz (RNAi)-assoziierte Ereignisse tragen zur Regulation auf Transkription übergeordneter bzw. untergeordneter Ebene bei (Esteller 2006; Grolleau-Julius et al. 2009). Hypomethylierung von CpG-reicher, Promoter-assoziierter DNA (CpG-Inseln) und Acetylierung von Histonen führen zur aktiven Transkription der betroffenen DNA-Abschnitte, während Hypermethylierung der DNA und Hypoacetylierung, sowie Methylierung der Histone die Transkription unterdrücken. DNA-Methylierungsmuster werden zum großen Teil im Fötus festgelegt. Es gibt Hinweise, dass sich das epigenetische Muster im adulten Organimus aber nicht nur aufgrund von Umwelteinflüssen, sondern auch während der Alterung eines Organismus verändert (Fraga et al. 2005; Gravina and Vijg 2010). Es wurde berichtet, dass der Methylierungsgrad von DNA in vielen Geweben verschiedener Organismen, u. a. auch im Menschen, im Laufe des Alters abnimmt. Eine mögliche Ursache könnte die reduzierte Aktivität von DNMT1 darstellen (Lopatina et al. 2002). Aber auch Helikasen der SNF2Superfamlilie, wie z.B. ATRX (alpha Thalassemia/mental retardation syndrome X-linked) und HELLS (helicase, lymphoid-specific) könnten involviert sein, da sie ebenfalls als Modulatoren der DNAMethylierung fungieren (Sun and Arceci 2005). HELLS -/- Mäuse zeigen neben frühzeitiger Alterung, inklusive Sarkopenie und Osteoporose, auch eine Abnahme des Methylierungsgrades (Sun et al. 2004). Das Expressionsmuster von HELLS ist umgekehrt zur Expression von CDKN2A während der invitro Alterung von Fibroblasten. Die P16-Expression wird in prä-seneszenten Zellen unterdrückt durch die direkte Interaktion von HELLS mit dem P16-Promoter und die Rekrutierung von HistonDeacetylasen (HDAC1, HDAC2) (Zhou et al. 2009). Andere Arbeitsgruppen postulierten eine indirekte Wirkung von HELLS auf die P16-Expression, indem die Helikase die Expression des P16-Inhibitors BMI1 (BMI1 polycomb ring finger oncogene) steuert (Sun et al. 2004; Sun and Arceci 2005). Weitere Befunde weisen darauf hin, dass HELLS bei der Methylierung von Stemness-Genen, wie z.B. OCT4 (POU5F1, POU class 5 homeobox 1) über die Rekrutierung der DNA-Methyltransferase DNMT3B eine tragende Rolle spielt. Dies könnte einen möglichen Mechanismus für den Verlust des StemnessCharakters von multipotenten Zellen darstellen (Xi et al. 2009). Abnahme der DNA-Methylierung während der Alterung konnte aber nicht universell nachgewiesen werden. Je nachdem welches Mausmodell herangezogen, bzw. welches Gewebe oder Gen untersucht wurde, zeigte sich ein entweder verringerter, erhöhter oder gar nicht veränderter Methylierungsgrad (Yung and Julius 2008). In Studien an Lymphozyten von eineiigen Zwillingen jungen Alters verglichen mit Zwillingspaaren mittleren Alters wurden auch Veränderungen des Acetylierungsgrades von Histonen H3 und H4 detektiert (Fraga et al. 2005). Tierversuche ergaben, dass die Gabe von HDAC1 (histone deacetylase 1)- und HDAC2-Inhibitoren die Lebensdauer verlängert (Chang and Min 2002; Zhao et al. 2005). HELLS interagiert ebenfalls mit HDAC1 und behindert auf diese Weise die Expression von P16. Durch Bindung an den CDNKN2A-Promoter und Rekrutierung von HDAC1 werden die angrenzenden Histone deacetyliert. Der Eintritt in den Zustand der Seneszenz wird somit verzögert (Zhou et al. 2009). Ein weiterer epigenetischer Mechanimus – RNA Interfernz – setzt auf Ebene der Transkription an. RNAi ist ein Mechanismus in vielen Eukaryoten, der darauf basiert, dass doppelsträngige RNA mittels zelleigener Proteinkomplexe (DICER und RISC) erkannt und zerstört wird. Dies dient einerseits als Schutz gegen Viren, die ihr Genom mittels doppelsträngiger RNA übertragen, aber auch zur Regulation der Translation, indem der Organismus small-interference (siRNA) oder mikroRNA (miRNA) selbst produziert, um komplementäre mRNA zu binden und zu zerstören. Auf diese Weise können Entwicklung und Genexpression posttranskriptional reguliert werden, und es gibt ebenfalls Anzeichen, dass auch die Alterung dadurch direkt beeinflusst wird (Zamore 2001; Grolleau-Julius et al. 2009). Die Lebensspanne von C. elegans kann z.B. durch Überexpression der spezifischen miRNA lin-4 (lineage 4) verlängert werden (Boehm and Slack 2005). 19

Einleitung 3.2.3.6

Genetische Prädisposition

Mutationen, die dazu führen, dass oben genannte Mechanismen aktiviert bzw. gestört werden, können die Alterung begünstigen oder sogar beschleunigen. Funktionseinschränkende Mutationen in DNA-Reparaturenzymen (siehe 3.2.3.2) stellen die Ursachen für viele Progerie-Syndrome dar. Das Werner Symdrom tritt im adulten Menschen aufgrund einer Mutation im WRN-Gen auf, das für eine RECQ-like Helikase codiert. WRN spielt eine Rolle bei der DNA-Reparatur, aber auch bei der Transkription (Yu et al. 1996; Bachrati and Hickson 2003). Das bei Kindern auftretende Hutchinson-Gilford Progerie-Syndrom wird durch eine Mutation im Gen LMNA, das für Lamin A codiert, hervorgerufen. Lamin A ist ein Protein der Kernhülle, wird aber auch im Zusammenhang mit Chromatinorganisation beschrieben (Eriksson et al. 2003; Andressoo and Hoeijmakers 2005). Fibroblasten von Patienten mit Hutchinson-Gilford zeigen in-vitro nach Bestrahlung keine bzw. kaum DNA-Reparatur (Epstein et al. 1973). Beide monogenetischen Krankheiten zeigen zeitlich gerafft alle typischen Merkmale der natürlichen Alterung, in klinischer und molekularer Hinsicht (Ding and Shen 2008). Es wird angenommen, dass auch der Vitamin D3-Metabolismus eine Rolle spielt und gesteigerte 1,25(OH)2D3-Aktivität die Alterung durch Erhöhung des Serumphosphatspiegels begünstigt. Da FGF23 und Klotho die Expression der 1α-Hydroxylase unterdrücken und in Folge den Vitamin D3-Metabolismus negativ regulieren, schützen sie vor verfrühter Alterung (Razzaque and Lanske, 2006; Razzaque et al., 2006). Dies konnte an Knockout-Modellen verdeutlicht werden. Klotho-/- und FGF23-/--Mäuse zeichnen sich durch einen sehr ähnlichen Phänotyp aus, der durch vorzeitige Alterung, vaskuläre Verkalkungen, erhöhten Phosphatspiegel und erhöhte 1,25-(OH)2D3-Konzentration gekennzeichnet ist (Kuro-o et al. 1997; Shimada et al. 2004; Drueke and Prie 2007). Einige Arbeiten zeigen jedoch auch, dass zumindest in-vitro auf zellulärer Ebene, 1,25-(OH)2D3 die Entstehung von Seneszenz verzögert. Humane MSC mit Langzeitstimulation von 1,25-(OH)2D3 traten später in den irreversiblen Proliferationsstopp ein als die Kontroll-Zellen (Klotz et al. submitted).

3.2.4

Immunseneszenz

Das Immunsystem ist ein evolutionär konserviertes Netzwerk an Schutzmechanismen und kann in Vertebraten in zwei Komponenten unterteilt werden: das angeborene und das adaptive Immunsystem. Das angeborene System setzt sich hauptsächlich aus Monozyten, Dendritischen Zellen und natürlichen Killer-Zellen zusammen. Das adaptive Immunsystem ist repräsentiert durch B- und TLymphozyten. Mit der Alterung eines Organismus gehen auch negative Veränderungen des Immunsystems einher, die als Immunseneszenz bezeichnet werden. Immunseneszenz betrifft das angeborene, als auch das adaptive Immunsystem und ist gekennzeichnet durch die funktionelle Abnahme von T- und B-Zellen, sowie Involution des Thymus und einem Zustand der chronischen Inflammation, der als „inflammaging“ bezeichnet wird (Weiskopf et al. 2009). Auf diese Weise wird die Immunkompetenz des Organismus herabgesetzt, wodurch sich wiederum die Anfälligkeit für Krankheiten und Infektion und damit auch die Sterberate im Alter erhöhen. Die Inzidenz von Autoimmunkrankheiten nimmt im Alter ebenfalls deutlich zu (Hasler and Zouali 2005; Ostan et al. 2008). Im adaptiven Immunsystem häufen sich während der Alterung die schwerwiegendsten Veränderungen an, da es sich ein Leben lang an neue Pathogene anpassen muss. Diese Adaptierung verläuft über Antikörper, die erkannt werden und die Immunreaktion auslösen. Menschen der heutigen Zeit haben eine Lebenserwartung von 80-120 Jahren, wodurch das Immunsystem eine viel längere Zeit infektiösen Antigenen ausgesetzt wird als je zuvor in der menschlichen Evolution. Dies ist möglicherweise eine der Hauptursachen für die Entstehung der Immunseneszenz (Larbi et al. 2008; Ostan et al. 2008).

Einleitung Eine weitere Ursache stellen die hämotopoetischen Stammzellen dar, deren Proliferationskapazität und Anzahl im Knochenmark mit dem Alter des Organismus abnimmt. Dadurch werden weniger BZellen produziert (Cancro 2005; Dykstra and de Haan 2008; Weiskopf et al. 2009). Chemische Komponenten bzw. deren differentielle Expression im gealterten Organismus tragen ebenfalls zur Entstehung von Immunseneszenz bei. Es wurde gezeigt, dass die Aktivität von NFKB (nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells), ein Transkriptionsfaktor für proinflammatorische Gene, in älteren Personen ansteigt und zur Entstehung von „inflammaging“ beiträgt (Grolleau-Julius et al. 2009). Ein NFKB-responsives Gen stellt IL6 dar, dessen Konzentration sich im Alter ebenfalls erhöht, und dessen Proteinprodukt u.a. den Promotor von DNMT1 reguliert (siehe 3.2.3.5) (Hodge et al. 2001). Es wird angenommen, dass vor allem epigenetische Faktoren zur Immunseneszenz beitragen (Grolleau-Julius et al. 2009). Weitere Immunsystem-assoziierte Gene, die im Alter differentiell exprimiert werden, sind IL2 und INFG (Interferon gamma) (Grolleau-Julius et al. 2009). Inflammation ist ein Mechanismus mit dem der Körper auf das Eindringen von Pathogenen, Verletzungen oder Irritationen reagiert und letztendlich die Heilung des betroffenen Gewebes initiiert. Eingeleitet wird die Inflammation durch die Akute-Phase-Reaktion, die erste, unspezifische Antwort auf die negativen, exogenen Reize. Immunkompetente Zellen sezernieren Zytokine, wie z.B. IL6, Il2, INFG, TGFA, TGFB und EGF, die über den Blutkreislauf zur Leber gelangen. Dort werden als Reaktion auf diese Botenstoffe über 30 Akute-Phase-Proteine in großen Mengen produziert und sezerniert, um den Wundheilungsprozess und weitere inflammatorische Reaktionen einzuleiten (Baumann and Gauldie 1994). Zu diesen Proteinen gehören auch die Akute-Phase Serum Amyloide A (A-SAA), SAA1 und SAA2. Anders als das im Menschen konstitutiv exprimierte SAA4, steigt die Konzentration von A-SAA im Blutplasma nach einer Verletzung oder Infektion bis zu 1000fach an (Marhaug 1983; Steel and Whitehead 1994). Der Hauptanteil an A-SAA wird in der Leber produziert, aber auch in anderen Zellarten konnte die vermutlich gekoppelte Expression von SAA1 und SAA1 nachgewiesen werden. In-vitro wurde SAA1- und SAA2-Expression nicht nur in Hepatozyten, sondern auch in Epithelzellen als Reaktion auf die Stimulation mit TNF, Il1 und IL6 beobachtet (Hagihara et al. 2004; Thorn et al. 2004). Aber auch in Osteoblastenvorläuferzellen werden SAA1 und SAA2 bei osteogener Differenzierung höher exprimiert (Kovacevic et al. 2008). SAA sind Apolipoproteine, die mit HDL (high density lipoprotein) assoziieren oder nach proteolytischer Prozessierung durch MMP1, 2, oder 3 in der extrazellulären Matrix hydrophobe Aggregate bilden. Diese Amyloid A Fibrillen führen zur Entstehung von Plaques und letztendlich zu Amyloidosen (Muller et al. 2000; Stix et al. 2001; van der Hilst et al. 2008). Erhöhte MMP-Produktion ist auch eine Konsequenz der Aktivierung des Rezeptors FPR2 (formyl peptide receptor 2) durch SAA (He et al. 2003). MMP fördern die Bildung von Amyloid-Fibrillen, die u.a. bei der Rheumatoiden Arthritis – einer chronisch entzündlichen Erkrankung – auftreten (Magnus et al. 1989; van der Hilst et al. 2008). Aber auch mit Alters-assoziierten Krankheiten, wie Arteriosklerose und Tumorentwicklung ist A-SAA in Verbindung gebracht worden (Mucchiano et al. 2001; Malle et al. 2009). Einen weiteren Rezeptor für SAA1 stellt TLR2 (toll-like receptor 2) dar (He et al. 2009). Aktivierung von TLR wirkt sich allgemein auf das angeborene, aber auch auf das adaptive Immunsystem aus (Manicassamy and Pulendran 2009; Iwasaki and Medzhitov). Eine Bindung an TLR2 resultiert in WTMäusen in einer erhöhten Aktivität von MAP-Kinasen und ERK1/2, sowie NFKB und der Expression responsiver Gene (Cheng et al. 2008). Makrophagen erhöhen die Expression von CSF3 wenn TLR2 durch SAA aktiviert wird, und dies kann zu Neutrophilie führen (He et al. 2009). SAA und Mechanismen der Inflammationsreaktion treten nicht nur bei akuten Entzündungsreaktionen auf, sondern sind Bestandteil des „inflammaging“ und tragen zur Alterung des Organismus bei (Dinarello 2006).

Einleitung

3.2.5

Auswirkung der Alterung auf Knochenhomöostase

Alter ist gekennzeichnet durch reduzierte Muskelmasse, erhöhten Körperfettanteil und reduzierte Knochenmasse, wobei 80% des Verlustes im trabekulären Knochen, dem Ort der höchsten metabolischen Aktivität, stattfindet (Duque 2008). Beim Knochenverlust ist ein Unterschied zwischen den Geschlechtern zu beobachten, deutlich mehr Frauen leiden unter stark reduzierter Knochenmasse, die zusammen mit polygenetischen Faktoren öfter zu Osteoporose führen können als bei Männern (siehe 3.3.1) (Langsetmo et al. 2010). In Frauen führt der Östrogenmangel nach der Menopause zu erhöhter Osteoklastogenese und Präosteoblastenbildung, gleichzeitig wird die Apoptose von Osteoblasten und Osteozyten gefördert (Duque 2008). Männer erleiden keinen abrupten, sondern einen langsamen, graduellen Abfall des Androgenspiegels (Venken et al. 2008). Auch hier ist der Mangel an Östradiol, und nicht Testosteron, der entscheidende, knochenreduzierende Faktor. Es wird aber angenommen, dass sich die Knochenresorption bei Männern im Alter nicht erhöht, sondern der Knochenverlust auf mangelnde Knochenformation zurück zu führen ist (Meier et al. 2005). Die Osteoklastogenese wird auch über Zytokine angeregt, wodurch mit der Alterung einhergehende chronische Inflammationskrankheiten, wie z.B. Osteoarthritis oder Rheumatoide Arthritis, und das „Inflammaging“ zur erhöhten Knochenresorption beitragen (Mundy 2007; Hardy and Cooper 2009). Eine weitere Eigenschaft des alternden Knochens in Tier und Mensch ist die Akkumulation von Fett im trabekulären Teil des Knochens im Knochenmark und die damit einhergehende Verdrängung des Knochenmarks. Es konnte gezeigt werden, dass die Anzahl an Adipozyten im Knochenmark mit dem Alter ansteigt (Duque 2008). Alterung ist auch assoziiert mit der Verkalkung von weichem Gewebe, wie z.B. bei der Arteriosklerose, eine Krankheit bei der es in Blutgefäßen zur Bildung mineralisierter Ablagerungen kommt, ähnlich wie bei der Knochenmatrixmineralisierung (Anagnostis et al. 2009). 3.2.5.1

Auswirkungen der Alterung auf MSC

Die Alterung von MSC wurde in-vitro intensiv studiert. Die Zellen treten in Kultur nach 20-40 Populationsverdopplungen in den Zustand der Seneszenz ein (Stenderup et al. 2003), gekennzeichnet durch Zunahme an Zellgröße, eine abgeflachten Morphologie, stärkere Ausprägung von dendritenartigen Ausläufern und positive β-Galaktosidase-Färbung (Sethe et al. 2006). Humane MSC aus älteren Spendern treten früher in den Zustand der Seneszenz ein als hMSC aus jungen Spendern (Stenderup et al. 2003). Auch morphologisch gibt es Unterschiede zwischen hMSC aus Spendern verschiedenen Alters: hMSC isoliert aus jungen Spendern weisen zu Kulturbeginn eine spindelförmige Zellform auf, die in hMSC aus älteren Personen nicht oder kaum mehr auftritt. Mit der in-vitro Kultivierung nimmt die Anzahl an Zellen mit Spindelform ebenfalls ab (Baxter et al. 2004). Bei der Analyse der β-Galaktosidase-Aktivität zeigten sich bei hMSC aus Patienten variierenden Alters keine Unterschiede (Stenderup et al. 2003). Jedoch wird angenommen, dass β-Galaktosidase-Färbung einen limitierten, und somit keinen geeigneten Marker für die in-vivo-Alterung darstellt (Severino et al. 2000). Weitere Untersuchungen zu den Eigenschaften gealterter hMSC liefern widersprüchliche Ergebnisse. Es wurde postuliert, dass die Anzahl an CFU während der in-vivo-Alterung abnimmt (Baxter et al. 2004) oder aber sich nicht verändert (Stenderup et al. 2001). Auch wurde gezeigt, dass mit dem Alter die Größe der CFU abnimmt. Große Kolonien bestehen aus vielen spindelförmigen Zellen, während kleine Kolonien aus großen, abgeflachten (seneszenten) Zellen aufgebaut sind (Sethe et al. 2006). Die Telomerlänge ist ebenfalls betroffen. Vergleiche zwischen MSC aus frühen Passagen und nach Kultivierung bis zur Seneszenz weisen deutliche Unterschiede in der Telomerlänge auf. Je kürzer die Telomere desto mehr Populationsverdopplungen haben die MSC durchlaufen. Dies korreliert mit der in-vivo-Situation: die Telomere von hMSC aus älteren Patienten sind nach identischer Kultivierungszeit kürzer als die Telomere von hMSC aus jungen Spendern (Bellantuono et al. 2009).

Einleitung Widersprüche hingegen traten bei Untersuchungen zum osteogenen Differenzierungspotential auf: es wurden Hinweise gefunden, dass keine Unterschiede zwischen hMSC aus jungen Spendern verglichen mit hMSC aus älteren Spendern existieren (Stenderup et al. 2001). Die Mehrheit hingegen berichtet, dass das osteogenen Differenzierungspotential proportional zum Alter der Spender abnimmt (Sethe et al. 2006). Diese Diskrepanzen könnten auf die Anwendung unterschiedlicher Methoden oder aber auch auf die Isolation der hMSC aus unterschiedlichem Gewebe zurückzuführen sein (Bellantuono et al. 2009). Kein Einfluss des Alters der Spender konnte bei der Differenzierung von hMSC in die adipogene bzw. chondrogene Richtung festgestellt werden (Muraglia et al. 2000). Während der in-vitro-Kultivierung bis zur Seneszenz verlieren die Zellen jedoch die Fähigkeit, in Osteoblasten und Chondrozyten zu differenzieren. Nur die adipogene Differenzierung wird nicht beeinflusst (Vacanti et al. 2005). In-vivo konnte dies bestätigt werden: alte hMSC präferieren die Differenzierung in die adipogene Richtung, wodurch sich der Fettanteil innerhalb des Knochens im Alter erhöht (Ross et al. 2000). Dieser „adipogene Umschalter“ wird auch als eine der Ursachen für die Entstehung der senilen Osteoporose aufgeführt (siehe 3.3) (Rosen et al. 2009). Die differenzielle Genexpression in gealterten hMSC ist für ausgewählte Gene ebenfalls bekannt. TGFB wird in gealterten hMSC geringer exprimiert, ebenso BMP2 und 4. Die Sekretion von IL6 als proinflammatorisches Protein steigt mit dem Alter des Spenders an (Sethe et al. 2006). Die Akkumulation von ROS konnte bei der in-vitro- als auch der in-vivo-Alterung nachgewiesen werden (Young et al. 2001; Droge 2003); ebenso die Abnahme von Antioxidantien, wodurch die Zellen unter erhöhtem oxidativem Stress leiden (Sethe et al. 2006). Die Alterung von Zellen wird auch durch extrinsische Faktoren stark beeinflusst. In in-vitro Versuchen wurde gezeigt, dass bei Kultivierung von hMSC in Serum von gealterten Personen das osteogene Differenzierungspotential abnimmt, während sich das adipogene nicht verändert (Abdallah et al. 2006). In den Zellnischen der MSC könnten in-vivo ähnliche Wechselwirkungen ablaufen. Im Knochenmark wird das Wachstum der MSC z. T. durch hämatopoetische Zellen kontrolliert (Friedenstein et al. 1992). Eine Alterung dieser Immunzellvorläufer und damit einhergehender Funktionsverluste (Greenwood and Lansdorp 2003) könnte sich auch negativ auf die MSC auswirken. Auch Proteoglykane und Glycosaminoglykane können die Differenzierung von MSC – zumindest invitro – beeinflussen. Wenn die Synthese dieser Proteinkomplexe gestört wird, reduziert dies auch die MSC-Proliferation in-vivo. Eine Zunahme der Glykation – also das Anlagern von Kohlenhydratgruppen – an Kollagen wurde auch im alternden Organismus beobachtet und führt in-vitro zur Inhibition der Adhäsion von MSC an diese Kollagenfasern. Glykiertes BSA im Kultivierungsmedium inhibiert sogar die Proliferation und Differenzierung von MSC und erhöht die ROS-Akkumulation, sowie die Apoptoserate (Sethe et al. 2006). Untersuchungen an hMSC aus gealterten Personen zeigten keine Abnahme der zellulären Antwort auf mechanischen Stress (Klein-Nulend et al. 2002). Zusammengefasst beeinflusst die Alterung der MSC deren Proliferation und Differenzierungskapazität negativ. Dadurch stehen dem Organismus die nötigen Vorläuferzellen für die Knochenregeneration höchstwahrscheinlich nur noch begrenzt zur Verfügung (Fehrer and Lepperdinger 2005). Der Verlust von Selbstregeneration und Differenzierungskapazität der Stammzellen wirkt sich innerhalb des Organismus natürlich auch auf das umgebende Gewebe aus und trägt somit höchstwahrscheinlich zur Alterung des gesamten Organismus bei (Sethe et al. 2006; Bellantuono et al. 2009).

Einleitung

3.3 Osteoporose 3.3.1

Gestörte Knochenhomöostase bei Osteoporose

Primäre Osteoporose ist eine polygenetische Erkrankung, die ab der 4. Lebensdekade gehäuft auftritt und durch eine starke Reduktion der Knochenmasse, vor allem trabekulär (Duque 2008), sowie verminderter Knochenfestigkeit und Knochendichte gekennzeichnet ist. Wie im gealterten Knochen kommt es zu erhöhter Knochenresorption und reduzierter Knochenformation. Östrogenmangel führt in beiden Geschlechtern zur Knochenresorption (Jilka 2003). Ca. 50% aller kaukasischen Frauen Ende 80 leiden an Osteoporose (Ralston 2005; Jakob et al. 2007). Zumindest bei Frauen ist die Grenze zwischen natürlichem, Alters-bedingtem Knochenverlust und Osteoporose offiziell festgelegt. Laut der Weltgesundheitsorganisation liegt eine Osteoporose vor, wenn die Knochenmineraldichte – gemessen mittels der Knochendichtemessung – um 2,5 Standardabweichungen unter dem statistischen Mittelwert gesunder, prämenopausaler Frauen liegt (Bartl 2008). Diese Frauen haben ein moderates bis starkes Risiko für Fragilitätsfrakturen, die ohne adäquate Krafteinwirkung zu Stande kommen (Langsetmo et al. 2010). Typischerweise betreffen diese Frakturen die Wirbelsäule, den Radius und den Femur. Die größten Risikofaktoren der primären Osteoporose stellen neben dem Alter genetische Ursachen, Bewegungsmangel und bei Frauen die Menopause dar (Jakob et al. 2007). Sekundäre Osteoporose ist nicht Alters-bedingt und tritt aufgrund unterschiedlichster Störungen auf, u.a. durch Hypogonadismus, hämatologische Erkrankungen, Metastasierung eines Tumors oder medikamentös (Bartl 2008). Zum Beispiel führt Langzeitgabe von Glucocorticoiden (de Gregorio et al. 2006) oder Protonenpumpenhemmern (Sipponen and Harkonen 2010) zum Knochenverlust. Im Folgenden wird jedoch ausschließlich auf die senile bzw. primäre Osteoporose eingegangen.

3.3.2

Ursachen für Osteoporose 3.3.2.1

Alterung

Der gealterte Körper neigt zum Knochenverlust (siehe 3.2.5), hauptsächlich bedingt durch Veränderungen im Hormonspiegel (siehe 3.3.2.2). Fast alle monogenetischen Mausmodelle für frühzeitige Alterung – z.B. HELLS-/-, Klotho-/-, FGF23-/- – weisen eine Osteoporose auf (Kuro-o 2001; Shimada et al. 2004; Sun et al. 2004), wobei diese genetischen Defizienzen den Knochenmetabolismus nicht zwangsläufig direkt beeinflussen müssen. Alterung steht auch indirekt mit der Knochenumbaurate in Zusammenhang. Z. B. kann die Haut von gealterten Menschen bei Sonneneinstrahlung weniger effizient Vitamin D3 produzieren (Bandeira et al. 2006). Des Weiteren ist die Kalziumabsorption in Dünndarm (Marks et al. 2007) und im Magen durch reduzierte Säureproduktion (Bhutto and Morley 2008) ebenfalls reduziert. Die ganzheitliche Alterung des Organismus stellt somit einen der größten Risikofaktoren für die Entstehung von Osteoporose dar. 3.3.2.2

Veränderungen im Hormonspiegel

Der mit dem Alter sinkende Östrogenspiegel leitet die erhöhte Knochenresorption ein. Bei Frauen geht die Östradiol-Synthese in den Ovarien abrupt zurück, so dass postmenopausal nur noch ein schwächeres Sexualhormon – das Östron – aus Androgenen in der Nebenniere produziert wird (Chahal and Drake 2007). Bei Männern fällt der Androgenspiegel langsamer und kontinuierlich ab, wodurch auch die Östradiol-Synthese sinkt. Die geschlechtsspezifische, unterschiedliche Expression von Östrogen führt dazu, dass – gemessen über die gesamte Lebensspanne – im Gegensatz zu Frauen (40%) nur 15% der Männer ein Risiko für Fragilitätsfrakturen entwickeln (Venken et al. 2008). Die 24

Einleitung Behandlung von Osteoporose-Patienten mit Östrogen oder Raloxifen (selektiver ÖstrogenrezeptorModulator) erhöht die Knochendichte wieder, hat aber viele negative Nebeneffekte (Sweet et al. 2009) Im Alter ist eine Abnahme von Vitamin D3 zu beobachten, bedingt u.a. durch reduzierte Vitamin D3Produktion in der Haut und Abnahme der VDR-Expression im Magen. Dadurch kommt es zu einem Kalzium-Mangel, der wiederum die PTH-Synthese anregt. Über längere Zeit hohe PTH-Spiegel erhöhen die Knochenresorption (Lips 2006). Die Basistherapie bei Osteoporose-Patienten ist die gleichzeitige Kalzium- und Vitamin D3-Supplementation, wodurch das Risiko von Fragilitätsfrakturen in älteren Personen um bis zu 12% reduziert werden kann (Rahmani and Morin 2009). 3.3.2.3

Verhalten

Mechanische Belastung fördert den Knochenaufbau (siehe 3.1.3.4), daher kann Bewegungsmangel in der Jugend und im Alter zu reduzierter Knochendichte führen. Von einigen Arbeitsgruppen wurde postuliert, dass dies u.a. auch auf den altersbedingten Verlust der Mechanosensitivität zurückzuführen ist (siehe 3.3.3). Jedoch konnte die Knochendichte in postmenopausalen Frauen durch Einführung eines speziellen Bewegungsprogrammes wieder erhöht werden (Lirani-Galvao and LazarettiCastro). Neben Bewegungsmangel sind Rauchen, übermäßiger Alkoholkonsum, geringe Kalziumaufnahme in der Kindheit und Adoleszenz, sowie geringe Bestrahlung mit Sonnenlicht weitere psychosoziale Faktoren, die Osteoporose begünstigen. Der Mechanismus, mit dem Tabakkonsum den Knochenmetabolismus beeinflusst, ist noch nicht genau bekannt, jedoch konnte eine Korrelation zwischen Höhe des Zigarettenkonsums und Abnahme der Knochendichte festgestellt werden. Übermäßiger Alkoholkonsum kann über Leberschäden, Hypogonadismus oder Nährstoffdefizite den Knochen indirekt negativ beeinflussen. Alkohol wirkt sich jedoch auch direkt aus, indem der exzessive Genuss die Knochenmineralisierung stört und die PTH-Synthese erhöht (Metcalfe 2008) 3.3.2.4

Genetik

Osteoporose ist eine polygenetische Erkankung, deren Entstehung nicht durch eine einzelne Genmutation oder einen einzigen Single-Nukleotid-Polymorphismus (SNP) hervorgerufen werden kann. Dennoch sind die Varianzen in der Knochendichte zu 60-85% genetisch determiniert, und prämenopausale Frauen mit einer geringen Knochenmasse sind besonders gefährdet, in späteren Jahren eine Osteoporose zu entwickeln (Ralston 2005; Kawaguchi 2006). Es wurden mittlerweile einige Gene identifiziert, die mit geringer Knochendichte in Zusammenhang gebracht werden. Die Proteine dieser Gene sind oft Schlüsselfaktoren für die Hormonelle Steuerung der Knochenformation oder wichtiger Signalwege. Viele SNP des VDR-Gens sind mit geringer Knochendichte assoziiert (Liu et al. 2006b), ebenso zwei SNP im Exon 4 des Gens für Klotho (Kawaguchi 2006), wodurch die Vitamin D3 Signalgebung beeinflusst wird. Auch die Signalwirkung von Östrogen kann durch SNP verändert werden. Ein spezieller, homozygoter Polymorphismus im ESR1-Gen erhöht dessen mRNA-Produktion oder -Stabilität, wodurch letztendlich die Knochendichte erhöht und das Frakturrisiko reduziert wird. Der WNT-Signalweg ist ebenfalls betroffen. Inaktivierende Mutationen in LRP5 führen rezessiv zum Osteoporose-Pseudoglioma-Syndrom, während aktivierende Mutationen autosomal dominant die Knochendichte erhöhen (Ralston 2005). Auch WNT-Inhibitoren, wie Sclerostin, sind Kandidaten für die Osteoporose. Eine erhöhte Konzentration des Proteins wurde im Serum von Patienten mit immobilisationsbedingtem Knochenverlust nachgewiesen (Gaudio et al. 2010). Die Verfettung des Knochenmarks ist ebenfalls ein Marker für gealterten Knochen und die Aktivierung des Adipogenese-fördernden Proteins PPARG wird mit reduzierter Knochendichte in Zusammenhang gebracht.

Einleitung SNP in Wachstumsfaktoren wie IGF1 und TGFB1 sind auch bekannt. Ein SNP im Promotor von COL1A1 beeinflusst die Bindung des Transkriptionsfaktors SP1 negativ (Ralston 2005). Das RANKL/RANK/Osteoprotegerin-System ist ebenfalls betroffen, in den Genen aller 3 Proteine – TNFRSF11A, TNFRSF11B und TNFRSF11 – wurden SNP mit geringer Knochendichte assoziiert gefunden (Richards et al. 2009).

3.3.3

MSC und Osteoporose

Ebenso wie bei in-vivo-gealterten MSC gibt es auch bei MSC (MSC-OP) aus Patienten mit primärer Osteoporose widersprüchliche Ergebnisse zum Stammzellcharakter der Zellen. Stenderup et al. (2001) stellen keine Unterschiede in Proliferation oder osteogener Differenzierungskapazität von hMSC aus jungen, alten oder osteoporotischen Spendern fest. Diesen Daten widersprechend, postulieren Rodriguez et al. (1999) eine geringere Wachstumsrate und beeinträchtigte Differenzierung in die osteogene Rrichtung von MSC-OP verglichen mit Kontroll-MSC aus Patienten identischen Alters. Ein zugunsten der Osteoklastogenese verändertes Osteoprotegerin:RANKLVerhältnis konnte nach osteogener Differenzierung vom MSC-OP ebenfalls detektiert werden (Dalle Carbonare et al. 2009). Gegensätzliche Resultate erzielten auch Versuche zur Adipogenese. Zum einen wurden keine Unterschiede zwischen hMSC und hMSC-OP festgestellt (Justesen et al. 2002), zum anderen konnte eine erhöhte adipogene Differenzierungskapazität in hMSC-OP detektiert werden (Rodriguez et al. 2000). Letzteres ging einher mit erhöhter TGFB-Expression und verringerter COL1-Produktion. Auch die Mechanosensitivität in hMSC aus Osteoporose-Patienten ist verändert, sie produzieren u.a. weniger Prostaglandin E2 (Sterck et al. 1998).

3.4 Ziel der Arbeit Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Frage, welche funktionellen Einschränkungen durch Alterung in MSC entstehen. Zu diesem Zweck wurde das Genexpressionsmuster mit Hilfe von Mikroarray-Analysen in in-vitro-gealterten und in-vivo-gealterten humanen MSC untersucht. Im in-vitro-Alterungs-Modell wurden hMSC aus Patienten mittleren Alters isoliert und bis zur Seneszenz kultiviert. Die Gene mit differentieller Expression beim Vergleich von hMSC früher Passagen und seneszenter Passagen gaben Aufschluss über die Funktionsveränderungen in den Zellen aufgrund von Seneszenz. Es wurden ebenfalls Mikroarrays mit hMSC aus älteren Patienten durchgeführt, um einen Vergleich zwischen ex-vivo- und in-vitro-gealterten hMSC anzustellen und die Eignung der in-vitro-Alterung als Alterungsmodell bestimmen zu können. Da Osteoporose eine Erkrankung des gealterten Knochens darstellt, wurden auch hier Genexpressionsanalysen durchgeführt. Der Vergleich mit den Ergebnissen aus der in-vivo-Alterung ergab jene Gene, die ausschließlich aufgrund der Osteoporose differentiell exprimiert sind. Über monoklonale Systeme wurde die Funktion ausgewählter Gene und ihre Bedeutung für den Stammzellcharakter von hMSC analysiert, um Kandidatengene zu finden, die direkten Einfluss auf Alterung bzw. auf die Entstehung von Osteoporose ausüben.

Material und Methoden

4 Material und Methoden

4.1 Material 4.1.1

Geräte

ABI PRISM 310 Genetic Analyser

Applied Biosystems Deutschland GmbH, Darmstadt, Deutschland

Accu-jet Pipettierer

Brand, erhalten von Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland

AxioCam MRC Axioskop 2 Axiovert 25 BioPhotometer BioPhotometer Brutschrank, Inkubator HERAcell 240 Consort E835 Power Supply DNA-Engine Opticon für Real Time PCR Elektrophoresekammern Gene Pulser® II GeneChip Scanner 3000 Hochleistungs pH-mV-Meter Micro-Pipetten Microplate-Reader, Tecan Sunrise ELISA Reader

Zeiss, Jena, Deutschland Zeiss, Jena, Deutschland Zeiss, Jena, Deutschland Eppendorf, Hamburg, Deutschland Eppendorf, Hamburg, Deutschland Heraeus, Kleinostheim, Deutschland Sigma-Aldrich Gmbh, München, Deutschland BioRad, München, Deutschland peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland BIO-RAD, München, Deutschland Affymetrix UK Ltd., High Wycombe, UK WTW, Weilheim, Deutschland Eppendorf, Hamburg, Deutschland Tecan, Crailsheim, Deutschland

Mikropipetten 10µl, 100µl, 1000µl Mikroskop Multipipette plus Orion II Microplate Luminometer Perfect BlueTM `Semi Dry‘-Blotter SedecTM M

Eppendorf, Hamburg, Deutschland Wilovert, Heinse Ziller, Hund, Bonn, Deutschland Eppendorf, Hamburg, Deutschland Berthold Detection Systems, Pforzheim, Deutschland peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland

Pipetboy SDS-PAGE-Kammer (Protean II xi Cell) Sonofikator Sonoplus Sterilwerkbänke Thermocycler MJ Research

BRAND, Wertheim, Deutschland BioRad, München, Deutschland BANDELIN electronic, Berlin, Deutschland Heraeus Lamin Air®, Burladingen, Deutschland Biozym Diagnostik GmbH, Hessisch Oldendorf, Deutschland

Thermocycler peQSTAR Thermocycler Primus Thermocycler Primus 25 Thermocycler PTC-200 Peltier Thermal Cycler UV-Transilluminator mit Video, Kamera Modul

peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland MWG-BIOTECH, Ebersberg, Deutschland peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland Biozym Diagnostik GmbH, Hessisch Oldendorf, Deutschland LTF Labortechnik GmbH & Co. KG, Wasserburg, Deutschland 27

Material und Methoden

4.1.2

Verbrauchsmaterial

NucleoSEQ Columns PCR Softtubes 0,2ml Oprical Flat Cap Stripes LP Strip Tubes, 8-Strip, weiß Küvetten Elektroporationsküvetten, 2mm PVDF-Membran Blotting Papier, Typ: Whatman 3MM Chr Reaktionsgefäße (1,5ml, 2ml) Röhrchen (15ml, 50ml) Pipettenspitzen 25cm², 75cm² Zellkulturflaschen Zellschaber 24cm, 30cm 6 well, 12 well, 96 well Platten Petrischalen Sequenzierungscap Kryoröhrchen Leb-Tek Chamber Slides (4-Well) Filter (0,2 mm, 0,45 mm) Röntgenfilm

4.1.3

Macherey-Nagel, Düren , Deutschland Biozym, Hessisch Oldendorf, Deutschland Biozym, Hessisch Oldendorf, Deutschland Biozym, Hessisch Oldendorf, Deutschland Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland Greiner bio-one, Essen, Deutschland Greiner, Essen, Deutschland Abimed, Langenfeld, Deutschland Biochrom, Berlin, Deutschland Biochrom, Berlin, Deutschland Greiner, Essen, Deutschland Greiner, Essen, Deutschland ABIMED Analysentechnik GmbH, Langenfeld, Germany TPP AG, Trasadingen, Schweiz nunc, Rochester, NY, USA Satorius Stedim biotech, erhalten von Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland Amersham, erhalten von GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Deutschland

Chemikalien/ Reagenzien

2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) 2-Propanol 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-Dgalactopyranosid (X-Gal) Agar

Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

AppliChem, erhalten von Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland Agarose peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland Agarose peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland Alizarin Rot S Chroma-Gesellschaft Schmidt & Co., Stuttgart, Deutschland Aluminiumsulfat Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Aluminiumsulfatlösung (25%) Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Amersham™ ECL™ Prime Western Blotting GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Deutschland Detection Reagent Ammoniaklösung (25% Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Ampicillin Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland APS Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland Azeton Applied Biosystems Deutschland GmbH, Darmstadt, Deutschland 28

Material und Methoden β-Mercaptoethanol Borsäure

Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland AppliChem, erhalten von Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland Bovine Serum Albumin (BSA) für Zellkultur Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland Bromphenolblau Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland BSA für Restriktionsenzyme (100x) New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland Cruz Protein-Marker™ Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg, Deutschalnd Dimethylsulfoxid (DMSO) AppliChem, erhalten von Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland di-Natriumhydrogenphosphat Dihydrat Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland Dithiothreitol Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland dNTP Set peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland EDTA AppliChem, erhalten von Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland Ethanol Applied Biosystems Deutschland GmbH, Darmstadt, Deutschland Ethidiumbromid Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland Formaldehyd (37 %) Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Glutaraldehyd Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland Glycerin-Gelantine Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Glycerol Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Glycerol Gelantine Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland Hefeextrakt AppliChem, erhalten von Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland Hi-Di-Formamide Applied Biosystems Deutschland GmbH, Darmstadt, Deutschland Horse Serum PAA Laboratories GmbH, Cölbe, Deutschland HPLC-H2O Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland Kanamycin PAA Laboratories GmbH, Cölbe, Deutschland KCl AppliChem, erhalten von Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland K-Hexacyanoferrat II AppliChem, erhalten von Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland K-Hexacyanoferrat III AppliChem, erhalten von Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland Loading-Dye (6x) peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland Magermilchpulver AppliChem, erhalten von Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland Methanol Applied Biosystems Deutschland GmbH, Darmstadt, Deutschland MgCl2 peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland M-MLV-Puffer (5 x) Promega GmbH, Mannheim, Deutschland N,N-Dimethyl-Formamid Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland NaCl AppliChem, erhalten von Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland Natriumacetat Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland Natriumdodecylsulfat (SDS) Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Neomycin (G418-Sulfat) PAA Laboratories GmbH, Cölbe, Deutschland 29

Material und Methoden Oligo-(dT)-Primer O-Nitrophenyl-Galaktopyranosid Paraformaldehyd PCR-Puffer S (10 x) PCR-Puffer Y (10 x) peQGold 100bp DNA Leiter Plus peQGold 1kbp DNA Leiter peQGold Protein-Marker V Ponceau S Lösung Proteininhibitor Restriktionsenzym-Puffer 1-4 Roti®-Quant Rotiphorese® Gel 40 (40 %) SYBR Green I (10000 x) nucleic acid gel stain T4-DNA-Ligase-Puffer (x) TEMED Tris Tris-Cl TritonX-100 Trypanblau Trypton Tween 20 Vectashield Hard mit DAPI Xylencyanoblau Zitronensäure

4.1.4

peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland BioWhittaker Molecular Application, Rockland, ME, USA Promega GmbH, Mannheim, Deutschland Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland AppliChem, erhalten von Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland AppliChem, erhalten von Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland Vector Laboratories Inc., Linaris Biolog. Produkte GmbH, Wertheim, Deutschland Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland AppliChem, erhalten von Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland

Kits

Big Dye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit Nucleo Spin® Plasmid

Applied Biosystems Deutschland GmbH, Darmstadt, Deutschland Macherey-Nagel, Düren, Deutschland

Nucleo Spin® Xtra Maxi

Macherey-Nagel, Düren, Deutschland

Nucleo Spin RNA II

Macherey-Nagel, Düren, Deutschland

peqGOLD Gel Extraction Kit pcDNATM3.1/V5-His TOPO® Expression Kits GeneChip®3´IVT Express Kit GeneChip HG-U 133 Plus 2.0

peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland Invitrogen GmbH, Darmstadt, Deutschland Affymetrix UK Ltd., High Wycombe, UK Affymetrix UK Ltd., High Wycombe, UK

Material und Methoden

4.1.5

Primer 4.1.5.1

Primer für semi-quantitative PCR

Alle Primer für die semi-quantitative PCR wurden von der Firma biomers.net GmbH in Ulm, Deutschland bezogen. Tab. 1 Liste der verwendeten Primer für semi-quantitative PCR, inklusive Sequenzen, Länge des PCR-Produktes in bp, Annealing-Temperatur (TA) und MgCl2-Konzentration in mM. Für mit einem * gekennzeichnete Primer wurde in der PCRReaktion der PCR-Puffer Y verwendet, für alle anderen Reaktionen PCR-Puffer S.

Amplikon -Länge [bp] 490

TA [°C]

MgCl2 [nM]

1,5

293

1,5

AAGAAGATTGGTGGTT

167

2,0

CATGCTTTCAACGTGGAGTT

GTGGTCAGTGAGCCTGGGTA

415

2,0

CCNB1

GATGGAGCTGATCCAAAC

CTCCTGCAACAACCTGAA

186

2,0

CD24

AGGGCAATGATGAATGAGAAT

CTGGGCGACAAAGTGAGA

163

2,0

CDH1

ACTGGACCATTCAGTACAAC

GAACCGCTTCCTTCATAG

610

2,0

CDKN2A

GGTGCGGGCGCTGCTGGA

AGCACCACCAGCGTGTCC

210

1,5

CENPM

GGTGGAAGGCTTTAGGG

CAGGCTCTGCAAGAGTGA

376

2,0

CNTN3

AGCCCAAGCCTTCCTACCGA

CATGCTCCTGCACGCTCACA

330

2,5

COL10A1

CAGGCAACAGCATTAT

CATTTGACTCGGCATT

251

2,0

COL14A1

CAACCCCTGGAACACACTGC

304

2,5

COL4A4

AGAATATGTCACTTACTCCTACTT GC CCCATGATGCCACTCT

GGAATAACCACGACAAA

564

2,0

COMP

AGCATGCAGACTGCGTCC

CTTCTGGGACCGGCAGT

310

2,0*

CTNNB1

AGAGTAGCTGCAGGGGTCCT

TCTTGTGGCTTGTCCTCAGA

170

3,0

CTSZ

TTTCTGTGGCTGGGTG

TCGATGGCAAGGTTGT

151

2,0

DHFR

GGTTGGTTCGCTAAACTG

AACACCTGGGTATTCTGG

496

1,5

DKK1

ATGATGGCTCTGGGCGCAG

TTAGTGTCTCTGACAAGTGTGA

800

2,5

DPP4

AAGAGGCGAAGTATTATCAGC

GTAAGTGGCCCAGTTCAGTC

311

2,5

EEF1A1

AGGTGATTATCCTGAACCATCC

AAAGGTGGATAGTCTGACTGTTG

235

1,5

EGR2

ATGGGAGGAACATAGC

CAAGGCACCAAGGACA

244

2,5

ESR1

AAAGGTGGGATACGAAA

CAAGAGCAAGTTAGGAGC

477

2,0

FAS

CTTTCACTTCGGAGGATT

TCAGTCACTTGGGCATT

115

2,5

FGFR2

CTCCTCCATGAACTCCAAC

CTGGCTTATCCATTCTGTG

872

2,0

GPR116

ACTGACCAAATTACCGACAT

CAACTTGTTCATTGGCTTTA

469

2,5

HELLS

ATGCTGCCAGAACTAA

TGTAACAAGGCGATAA

354

2,0*

HMMR

AAGTGGCGTCTCCTCTATGA

CGATTTGAGTTGGCTATTTT

228

2,0

IBSP

GCCTGTGCTTTCTCAA

ACTTCTGCTTCGCTTT

467

2,5

Gen

Sequenz vorwärts *5`→ 3`+

Sequenz revers *5`→ 3`+

ALPL

TGGAGCTTCAGAAGCTCAACACCA ATCTCGTTGTCTGAGTACCAGTCC

BGLAP

ATGAGAGCCCTCACACTCCTC

GCCGTAGAAGCGCCGATAGGC

BMI1

CTCTGGGAGTGACAAG

CA2

Material und Methoden IGFBP5

GAATCCTTTGCGGTCACAAT

GACCGCAGAAAGAAGCTGAC

210

1,5

MAB21L2

TGGGTGCTACAGTTCG

CAGGCAGGAGATGAGC

246

2,0

MAP4

TGTGGAAGCCTTAAACTC

TCAGTCCCATCATTATTTC

164

2,0

MMP1

AAATCCCTTCTACCCG

AGCACATTCTGTCCCT

156

1,5

MMP3

CACTTCAGAACCTTTCCTGGCATC

GCTTCAGTGTTGGCTGAGTG

406

1,5

NOG

GCCAGCACTATCTCCACA

CAGCAGCGTCTCGTTCA

119

2,5

NR3C2

TTCGGATTCTTCATTCTCAG

GCATCCTGAAGCCTCATCCC

585

2,5

NRCAM

GGCGTCTGAGCAGTATTTGA

CGATAGCCTTGTAGGTGTCC

444

3,0

OCT4

CCGCCGTATGAGTTCTGTG

GATGGTCGTTTGGCTGAATA

360

2,5

PCDH10

GACCGACCTGATGTTTCTTA

CTATCTCCCTGTTCACTGTCTC

270

2,5

PDGFA

GGGTCCATGCCACTAAG

CAGCGTTTCACCTCCAC

187

2,5

PSG1

TGAAGTCAGCCTTGGTTTGG

TTTCCCTCTATGGGCATCTC

240

2,5

PSG5

TACAAAGGACAACTGATGGACC

CTGGGGAGGTCTGGACCAT

289

2,5

PTGS2

GCTGTCCCTTTACTTCATTC

TGGCATCTTGTGATAGTGTT

500

2,0

PTH1R

AGAGGAACAGATCTTCCTGCT

GTAGTCCGGACAGGGCACA

301

2,5

RGS4

AGTCCCAAGGCCAAAAAGAT

ACGGGTTGACCAAATCAAGA

220

1,5

RPS6KA2

GACGCAGCTAAAGACG

AGAGCAAAGTAGGTGGC

179

2,0

RUNX3

CTGGTGATCCTATTCCATTCCC

CCACTTTGGGCCTTACAGACG

378

2,0

AGCACCATGAAGCTTCTCA

TGTACCCTCTCCCCGCTT

452

2,0

ACATCGGCTCAGACAAAT

TTTCCACAAATTCCACCT

352

2,0

TCAGCTACAGCACAGATCAG

TCTCAGCTTCTCTGGACATA

418

2,0

SAA2

TCAGCTACAGCACAGATCAG

GATGCCTATTATATGCCAT

507

2,0

SECTM1

CCCTTGGGACCCTCCTGTTT

AGAAGGCGTTGGAGATGTTGC

141

2,5

SFRP4

420

1,5

SOST

CGAGGAGCTGGTGGACGTGAACT TCGAGGGATGGGTGATGAGGACT G TGAA CTCTGCCACTAACTTGCT GGCGGATGTGATTTCTA

480

2,0

SOX11

GGAGGAGGTGAGAAAGGAAAT

GAACTGATAGAAACTCGCATCG

276

2,5

SPP1

ACGCCGACCAAGGAAAACTC

443

1,5

TGFB1

TGGTGGAAACCCACAACG

GTCCATAAACCACACTATCACCTC G AAGGCGAAAGCCCTCAAT

320

2,5

TGFB2

CCAAAGGGTACAATGCCAACT

GGACACGCAGCAAGGAGAAG

134

2,0

TK1

TCCCTGACATCGTGGAGTT

TGCCGAGCCTCTTGGTAT

198

2,5

TNFRSF11 AAGGAGCTGTGCAAAAGGAA

ACTTGGGATTTTGATGCTGG

382

2,5

TP53

CCTCCTCAGCATCTTATCCG

GCACAAACACGCACCTCAAA

260

1,5

VEGFA

TCTTCAAGCCATCCTGTGTG

TGTTGTGCTGTAGGAAGCTCA

165

2,5

WNT5B

ATTTACTGTCTGTCCACCACG

TCCCGCCACCTTCATAG

149

2,0

SAA1 SAA1 SAA2

Material und Methoden 4.1.5.2

Sequenzierungsprimer

Tab. 2 Liste der verwendeten Primer für Sequenzierungs-PCR, inklusive Sequenzen. Primer für SAA sind komplementär sowohl für SAA1 als auch SAA2.

Gen/Vektor

Elongationsrichtung

Sequenz 5`→ 3`

SAA1/SAA2

vorwärts

GTGCGGAGGACTCGCTGG

SAA1/SAA2

vorwärts

ACTTCCATGCTCGGGGGAAC

SAA1

vorwärts

AGCACCATGAAGCTTCTCA

SAA1

rückwärts

TGTACCCTCTCCCCGCTT

SAA2

vorwärts

TCAGCTACAGCACAGATCAG

SAA2

rückwärts

TCTCAGCTTCTCTGGACATA

pcDNA3.1(+)

rückwärts

TAGAAGGCACAGTCGAGG

pcDNA3.1(+)

vorwärts

TAATACGACTCACTATAGGG

4.1.6

Enzyme

BamHI

New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland Macherey-Nagel, Düren, Deutschland New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland Promega GmbH, Mannheim, Deutschland Macherey-Nagel, Düren, Deutschland New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland Promega GmbH, Mannheim, Deutschland peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland

DNase EcoRV M-MLV Reverse Transkriptase RNase SSP1 T4-DNA-Ligase Taq DNA-Polymerase

4.1.7

Antikörper 4.1.7.1

Primärantikörper

Alle Primärantikörper wurden von der Firma Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg, Deutschland, bezogen.

Tab. 3 Liste der verwendeten Primärantikörper. Alle Antikörper wurden von der Firma Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg, Deutschland, bezogen.

Antikörper anti-HELLS anti-P16 anti-GAPDH

Bezeichnung Lsh (H-4) p16 (C-20) GAPDH (A-3)

Details mouse monoclonal IgG1 rabbit polyclonal IgG mouse monoclonal IgG1 33

Material und Methoden 4.1.7.2

Sekundärantikörper

Tab. 4 Liste der verwendeten Sekundärantikörper.

Antikörper anti-rabbit anti-rabbit anti-mouse anti-mouse

4.1.8

Bezeichnung Northern Lightstm Anti-rabbit IgG Anti-rabbit IgG (whole molecule) Northern Lightstm Anti-rabbit IgG Anti-mouse IgG (Fc Specific)

Konjugat, Host-Spezies NL-557, donkey Peroxidase, goat NL-557, donkey Peroxidase, goat

Proteine

Recombinantes, humanes Apo-SAA1 (rhSAA1) Mouse IgG1 Rabbit IgG

4.1.9

Firma R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland

PeproTech GmbH, Hamburg, Deutschland DAKO Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland DAKO Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland

Kompetente Bakterien

One Shot® Stbl3™ Chemically Competent E. coli

Invitrogen GmbH, Darmstadt, Deutschland

NEB 5-alpha Competent E. coli

New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland

Material und Methoden

4.1.10 Vektoren

Abb. 5 Vektorkarte von pcDNA 3.1/ V5-His TOPO® aus dem pcDNA GmbH, Darmstadt, Deutschland

3.1/ V5-His TOPO® Expression Kit von Invitrogen

Abb. 6 Vektorkarte pcDNA 3.1 (+) und (-) von Invitrogen GmbH, Darmstadt, Deutschland. In der vorliegenden Arbeit TM wurde ausschließlich der pcDNA 3.1 (+) verwendet.

4.1.11 Software und Internet-Seiten ABI PRISM 310 Collection ABI PRISM Sequencing Analysis v 3.4 AxioVision 4.4.1.0

Applied Biosystems Deutschland GmbH, Darmstadt, Deutschland Applied Biosystems Deutschland GmbH, Darmstadt, Deutschland Zeiss, Jena, Deutschland 35

Material und Methoden BioCapt MW, Version 99 BioEdit BioProfil Bio I.D., Version 99 DNA Engine Opticon®2 GeneChip Operating Software 1.2 Significance Analysis of Mikroarrays Spotfire DecisionSite for Functional Genomics 9.1.1

GOstat Analysis NCBI Pubmed NCBI Blast GeneCards Primer3 Affymetrix NetAffx Analysis Center

LTF, Wasserburg, Deutschland Tom Hall, Ibis Therapeutics, Carlsbad, CA, USA LTF, Wasserburg, Deutschland BioRad, München, Deutschland Affymetrix UK Ltd., High Wycombe, UK Tool herhalten von http://wwwstat.stanford.edu/~tibs/SAM/ TIBCO Software Inc., Göteborg, Schweden

http://gostat.wehi.edu.au http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAG E_TYPE=BlastHome http://www.genecards.org http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ http://www.affymetrix.com/analysis/index.affx

4.1.1 Lösungen für Molekularbiologie und Proteinbiochemie 10 x TBE (Tris-Borat-EDTA-Puffer), pH 8,3 0,89 M Tris 0,89 M Borsäure 0,2 M EDTA (pH 8) Add a 1 l Aqua bidest. DNA-Ladepuffer 5,4 M 0,5 M 4,64 mM 3,73 mM Add a 50 ml

Glycerol EDTA (pH 8) Xylencyanoblau Bromphenolblau Aqua bidest.

DNA-Marker 0,05 µg/µl 0,6 x Add a 1 ml

peQGold 100bp/ 1kb DNA Leiter Loading Dye Aqua bidest.

dNTP (Desoxyribonukleosidtriphosphate) dATP 20 mM dCTP 20 mM dGTP 20 mM dTTP 20 mM Add a 100 µl HPLC-H2O

Material und Methoden 10 x MOPS (3-[N-Morpholino]propansulfonsäure) 220 mM MOPS 50 mM Natriumacetat 10 mM EDTA Add a 50 ml HPLC-H2O Denaturierungs-Mix 10 % 7,4 % 1,5 x 1,4 x Add a 10 ml

deionisiertes Formamid Formaldehyd (pH > 4) MOPS DNA-Ladepuffer HPLC-H2O

10 x PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung), pH 7,6 1,37 M NaCl 27 mM KCl 0,1 M Na2HPO4 0,76 M KH2PO4 Add a 1 l Aqua bidest. 10 x TBS (Tris-gepufferte Saline), pH 7,2 - 7,4 0,2 M Tris-base 1,5 M NaCl Add a 1 l Aqua bidest. 1 x TTBS (Tween Tris-gepufferte Saline ), pH 7,2 - 7,4 1% Tween-20 1x TBS Add a 1 l Aqua bidest. Homogenisationspuffer 50 mM Tris (pH 7,5) 1 mM EDTA Add a 50 ml HPLC-H2O 2 x Laemmli-Puffer 100 mM 200 mM 4% 0,2 % 20 % 2%

Tris-Cl (pH 6,9) Dithiothreitol SDS Bromphenolblau Glycerol β-Mercaptoethanol

1 x Laufpuffer 200 mM 25 mM 0,1 % Add a 1 l

Glycin Tris-Cl SDS Aqua bidest.

Material und Methoden 10 x Transferpuffer (4 °C) 0,25 M Tris 2M Glycin 20 % Methanol Add a 1 l Aqua bidest. Blocklösung für Western-Blot 2,5 % Magermilchpulver 2,5 % BSA 2,5 % Horse Serum Add a 100 ml 1 x PBS/ 0,1 % Tween Stripping Buffer 62,5 mM 100 mM 2%

Tris-HCL (pH 6,8) β-Mercaptoethanol SDS

Zitrat-Azeton-Formaldehyd-Lösung 24,5 % Citrate Solution (Alkaline Phosphatase, Leukocyte Kit No. 86C) 63,7 % Aceton 3,02 % Formaldehyd (37 %) Formaldehyd/Glutaraldehyd-Fixierlösung 2% Formaldehyd 0,2 % Glutaraldehyd Add a 50 ml 1 x PBS 0,2 M Zitronensäure/Na-Phosphat (pH 6,0) 36,85 % 0,1 M Zitronensäurelösung (C6H8O7.H2O) 63,15 % 0,2 M di-Natriumhydrogenphosphat Dihydrat (Na2HPO4.H2O) β-Galaktosidase-Färbelösung 1 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) 40 mM Zitronensäure/Na-Phosphat (pH 6,0) 5 mM K-Hexacyanoferrat II 5 mM K-Hexacyanoferrat III 150 mM NaCl 2 mM MgCl2 Add a x ddH2O SA-β-Gal-Lösung 50 mM 1 mM 40 mM 5 mM Add a 200 µl

2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (pH 5,1) MgCl2 β-Mercaptoethanol O-Nitrophenyl-Galaktopyranosid ddH2O

Alizarin Rot S-Lösung 1% 0,25 % Add a 100 ml

Alizarin Rot S (Alizarin sulfosaures Natrium) Ammoniaklösung (25 %) ddH2O

Material und Methoden Kernechtrot-Lösung 0,5 g/l 0,01 g/l Add a 100 ml

Aluminiumsulfat Kernechtrot Aqua bidest.

Trypanblau-Lösung 0,4 % 0,9 % Add a 40 ml

Trypanblau NaCl Aqua bidest.

4.1.2

Bakteriennährmedien/-nährboden

LB-Medium(pH 7,0) 5 g/l 10 g/l 10 g/l 50 µg/ml Add a 800 ml

Hefeextrakt Trypton NaCl Ampicillin oder Kanamycin (nach dem Autoklavieren) Aqua bidest.

LP-Platten 10 g/l Add a 800 ml

Agar LB-Medium

SOC-Medium (pH 7,0) 5 g/l 20 g/l 0,5 g/l 2,5 mM 10 mM 0,02 M Add a 1 l

Hefeextrakt Trypton NaCl KCl MgCl2 Glucose Aqua bidest.

4.1.3

Zellkulturmedien

Alle Nährlösungen und Reagenzien für die Arbeit mit eukaryotischen Zellen wurden von PAA Laboratories GmbH, Cölbe, Deutschland, bezogen, mit Ausnahme von Ascorbat (Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland). hMSC-Medium 500 ml 10 % 1x 50 µg/ml

DMEM Ham`s F12 FCS (fetal calf serum) Penicillin/Streptomycin (100x) Ascorbat

hMSC-TERT-Medium 500 ml 10 % 1x 1%

DMEM with Earle`s Salt FCS (fetal calf serum) Penicillin/Streptomycin (100x) L-Glutamin 39

Material und Methoden Osteogenes Differenzierungsmedium 500 ml DMEM High Glucose (4,5g/l) 10 % FCS (fetal calf serum) 1x Penicillin/Streptomycin (100x) 50 µg/ml Ascorbat 10 mM ß-Glycerophosphat 100 nM Dexamethason

4.2 Methoden 4.2.1

Molekularbiologische Methoden 4.2.1.1

Isolation von zellulärer RNA

Unabhängig von Zelltyp oder Behandlung wurden Zellmonolayer aus 75 cm2 oder 25 cm2 Kulturflaschen mittels des NucleoSpin® RNA II Kits von Macherey-Nagel isoliert. Hierbei wurden die Zellen nach gründlichem Entfernen des Kulturmediums mit 700 µl RA1-Puffer und 7 µl ß-Mercaptoethanol lysiert und einem Zellschaber vom Flaschenboden abgekratzt. Nach Überführung in ein steriles, RNAse-freies 1,5ml-Reaktionsgefäß wurden die Proben bei -20 °C gelagert. Die RNA-Isolation erfolgte nach den Protokollen des Herstellers. Die gereinigten Proben wurden nach Zugabe des gleichen Volumens an 70%igen Ethanol auf Silikagelmembran-Säulen pipettiert. Zur Eliminierung unerwünschter genomischer DNA wurde ein DNAse I-Verdau durchgeführt. Sonstige Schmutzstoffe wurden mittels entsprechender Waschpuffer entfernt, gefolgt von der Eluation in 40 µl RNase-freiem H2O. Um die Konzentration an RNA zu erhöhen, wurde der letzte Schritt wiederholt, indem der Durchfluss erneut auf die Säule aufgetragen wurde. Nach Bestimmung der Konzentration wurden die Proben bei -80 °C gelagert. 4.2.1.2

Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

Mit Hilfe eines Biophotometers konnte die Konzentration von Nukleinsäuren bestimmt werden. Zu diesem Zweck wurden in einer UV-durchlässigen Küvette 48 µl 1 mM TRIS-HCL (pH 7,5) bzw. HPLCH2O mit 2 µl isolierter RNA bzw. DNA gemischt. Als Reverenzwert diente 1 mM TRIS-HCL (pH 7,5) oder HPLC-H2O ohne Zugabe von Nukleinsäuren. Die photometrische Messung erfolgte bei einer Wellenlänge von 260 nm, dem Absorptionsmaximum von RNA und DNA, wobei ein OD 260 von 1 einer Konzentration von 40 µg/ml entspricht. Absorptionsmessungen von Proteinen, sowie von organischen Substanzen (z.B. Phenol) wurden bei 280 nm bzw. 230 nm durchgeführt. Mittels der Quotienten OD260/OD280 und OD260/OD230 konnte die Reinheit der Proben bestimmt werden. Reine RNA liegt bei einem OD260/OD280 von 2,0 vor; DNA sollte einen OD260/OD280 > 1,8 aufweisen. In beiden Fällen ist eine Verunreinigung durch organische Substanzen ab einem OD260/OD230 > 2,0 ausgeschlossen. 4.2.1.3

Reverse Transkription

Reverse Transkription ist ein Vorgang, bei dem ausgehend von einem mRNA-Template mittels einer Reversen Transkriptase komplementäre, einzelsträngige DNA (cDNA) generiert werden kann. Je 1 µg RNA wurde hierfür mit Oligo-(dT)-Primern (50 pmol/µl) versetzt und auf 18 µl mit HPLC-H2O aufgefüllt. Denaturierung von sekundären RNA-Strukturen, sowie Bindung der Oligo-(dT)-Primer an Poly(A)-Sequenzen der mRNA wurden durch 5-minütige Denaturierung bei 70 °C mit anschließender 40

Material und Methoden Inkubation auf Eis erreicht. Der Ansatz wurde mit einem Mix aus 1 x M-MLV Puffer, 0,8 mM dNTP, 8 U/µl M-MLV Reverse Transkriptase und HPLC-H2O auf 25 µl aufgefüllt. Die Elongation der cDNA – gestartet mittels der Oligo(dT)-Primer – erfolgte im Thermocycler bei 42 °C für 1 h und wurde abgestoppt durch eine finale, 10-minütige Inkubation bei 95 °C. Alle cDNA-Proben wurden nach der Reversen Transkription mit 25 µl HPLC-H2O verdünnt. Um eine genomische DNA-Kontamination ausschließen zu können, wurde bei jeder Reversen Transkription eine Negativ-Kontrolle ohne RNA pipettiert. Diese wurde mittels des Haushaltsgens EEF1A1 bei der semi-quantitativen PCR und anschließender Agarosegelelektrophorese überprüft. 4.2.1.4

Semi-quantitative Polymerase Kettenreaktion (PCR)

Die Polymerase Kettenreaktion dient zur Detektion und Amplifikation von DNA-Sequenzen mittels spezifischer Primer und einer hitzebeständigen DNA-Polymerase. Der Standard-Ansatz für die PCR setzte sich folgendermaßen zusammen: 1 x PCR-Puffer S (inklusive 1,5 mM MgCl2) oder PCR-Puffer Y (inklusive 20 mM MgCl2), 2,5 mM dNTP, 0,5 pmol/µl spezifischer sense-Primer, 0,5 pmol/µl spezifischer antisense-Primer, gegebenenfalls zusätzlichem MgCl2 (siehe 4.1.5) und 0,03 U/µl hitzestabiler Taq DNA-Polymerase. Pro Ansatz wurden 40 ng cDNA eingesetzt. Die PCR-Reaktion besteht aus einer Kette von sich wiederholenden Temperaturgefällen, beginnend mit einem Denaturierungsschritt, um DNA-Doppelstränge von einander zu lösen. Es folgt die Herabsetzung auf eine Primer-spezifische Temperatur, um die Bindung der Primer an einzelsträngige DNA zu gewährleisten (Annealing). Zum Schluss ist ein Elongationsschritt notwendig, bei dem die Taq DNA-Polymerase mittels dNTP den jeweiligen cDNA-Strang in 5`→3`-Richtung kopiert. Die StandardBedingungen für die PCR-Reaktion sind in Tab. 5 ersichtlich. Tab. 5 Bedingungen für semi-quantitative PCR im Thermocycler

Schritt

Temperatur [°C]

Zeit [s]

Initiale Denaturierung

240

Denaturierung

Annealing

Primer-spezifisch (siehe 4.1.5.1)

Elongation

30-120

Finale Elongation

600

Anzahl Zyklen 1 Primer-spezifisch (siehe 4.1.5.1) 1

Die Elongationszeit wurde entsprechend der Größe des Amplikons variiert: bei einer Größe < 500 bp wurde der PCR-Ansatz 30 s inkubiert, pro zusätzlicher 500 bp wurde die Zeit auf 30 s erhöht. Die Primerpaare (siehe 4.1.5.1) wurden so gewählt, dass sie an möglichst viele bzw. alle Isoformen des jeweiligen Gens binden. Des Weiteren wurde sichergestellt, dass sich die komplementären Sequenzen der Primerpaare vorzugsweise in mindestens 2 verschiedenen Exons befinden, um ungewollte Kontaminationen mit genomischer DNA nach der Agarosegelelektrophorese ausschließen zu können. Als Negativ-Kontrolle diente bei jeder PCR ein Ansatz ohne cDNA, um mögliche DNA-Kontaminationen in den verwendeten Reagenzien zu überprüfen.

Material und Methoden 4.2.1.5

Agarosegelelektrophorese

Agarosegele dienen zur Auftrennung von Nukleinsäuren entsprechend ihrer bp-Länge durch Anlegen eines elektrischen Feldes. Zu diesem Zweck wurden 1-2 %ige Agarosegele hergestellt, indem Agarose und 0,5 x TBE in einer Mikrowelle zum Kochen gebracht wurden. Nachdem sich die Agarose vollständig gelöst hatte, wurde Ethidiumbromid in einer Endkonzentration von 0,1 µg/ml zugegeben. Ethidiumbromid interkaliert in DNA oder RNA und fluoresziert unter UV-Licht. In Elektrophoreseschlitten mit entsprechenden Gelkämmen polymerisierten die Agarosegele und wurden anschließend in Gelelektrophoresekammern – befüllt mit 0,5 x TBE – überführt. 4.2.1.5.1

Nicht-denaturierende Agarosegelelektrophorese

Nicht-denaturierende Agarosegelelektrophorese wurde durchgeführt zur Visualisierung von DNAFragmenten. Hierbei wurden identische Volumina an DNA-enthaltenden Ansätzen (z.B. PCRProdukte, Restriktionsenzymverdaue von Plasmiden) mit je 2 µl DNA-Ladepuffer vermischt und in die mittels der Gelkämme entstanden Taschen geladen. Als Größenmarker zur Bestimmung der bp-Länge dienten 100 bp bzw. 1 kb Ladder, die DNA-Fragmente in definierten Größen enthalten. Durch Anlegen eines elektrischen Feldes (80 - 120 V, 150 mA) wanderten die negativ geladen DNASequenzen zur positiven Anode. Die daraus resultierenden Banden konnten in einem UVTransilluminator mittels UV-Licht detektiert und mit einer angeschlossenen Kamera, sowie dem BioCapt, Version 99-Programm dokumentiert werden. 4.2.1.5.2

Denaturierende Agarosegelelektrophorese

Zur Detektion von RNA-Degradation wurden von jenen RNA-Proben, die für MikroarrayHybridisierungen verwendet wurden, denaturierende Agarosegelelektrophoresen durchgeführt. Im Vergleich zur nicht-denaturierenden Gelelektrophorese wurde das Protokoll hinsichtlich der Probenvorbereitung geändert. Je 0,5 -1 µg isolierte RNA wurde mit 5 µl Denaturierungs-Mix vermischt und bei 65 °C 10 min inkubiert. Nach kurzer Abkühlung auf Eis wurden die Proben auf das Gel aufgetragen. Nicht degradierte RNA zeichnet sich durch definierte 28S- und 18S-Banden aus, wobei die 28S-Bande doppelt so intensiv fluoreszieren sollte wie die 18S-Bande. Im Falle von RNA-Degradation ist das 2:1 Verhältnis von 28S zu 18S nicht gegeben, des Weiteren sind Degradationsprodukte als Schmier bei geringer Größe sichtbar. 4.2.1.6

Densitometrie

Densitometrische Auswertung von Agarosegelen und Western-Blots wurden in ausgewählten Experimenten durchgeführt, um Unterschiede zwischen einzelnen Banden quantifizieren zu können. Hierfür wurde das Programm BioProfil Bio I.D., Version 99 verwendet. PCR-Produkt-Banden der verschiedenen Amplikons wurden auf jene der EEF1A1-PCR-Banden normalisiert. Proteine wurden auf GAPDH normiert. 4.2.1.7

Agarosegel-Eluation

Aufreinigung von DNA-Sequenzen wurde nach einem Restriktionsenzymverdau für die Klonierung, als auch für die Sequenzierung von PCR-Produkten verwendet. Hierbei wurden die DNA enthaltenen Proben auf ein 1 %iges Agarosegel aufgetragen und die Ethidiumbromid-Bande der gewünschten DNA-Sequenz nach Gelektrophorese unter UV-Licht mit einem Skalpell ausgeschnitten. Die 42

Material und Methoden Aufreinigung erfolgte mit dem peqGOLD Gel Extraction Kit nach Angaben des Herstellers. Der pH wurde vor der Übertragung auf HiBind®-Säulen mit 5 µl 3 M Na-Acetat (pH 4,6) eingestellt. Nach verschiedenen Waschschritten erfolgte die Eluation der DNA von der Säulenmatrix mit 30-50 µl DNAEluationspuffer. 4.2.1.8

DNA-Sequenzierung

Die Sequenzierung ist eine Methode, mit der man die Abfolge der Nukleotide in einem bestimmten DNA-Fragment identifizieren kann. Durch den zufälligen Einbau von ddNTP während der DNASynthese erfolgt ein sogenannter Kettenabbruch, wodurch unterschiedlich lange DNA-Fragmente entstehen, die an den 3´-Enden entweder ein ddATP, ddTTP, ddGTP bzw. ddCTP tragen. Jedes der vier ddNTP-Moleküle ist mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert. Mittels eines KapillarGelsystems werden die Fragmente der Größe nach aufgetrennt und mit einem Laser angeregt. Je nach Farbstoff wird Licht in spezifischer Wellenlänge emittiert. Diese Daten können gemessen und mit entsprechender Software schließlich zu einer Sequenz zusammengesetzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden für die Sequenzierungs-PCR das Big Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit verwendet. Ein PCR-Ansatz wurde hergestellt aus 1-2 µl PCR-/Geleluations-Produkt bzw. 150-300 ng Plasmid-DNA, 0,25 pmol sense oder antisense Primer, 0,5 x Big Dye sequencing v1.1 Buffer und 0,5 x Big Dye Terminator v1.1 Ready Reaction Mix. Die PCR-Bedingungen sind in Tab. 6 ersichtlich.

Tab. 6 Bedingungen für Sequenzierungs-PCR im Thermocycler

Schritt

Temperatur [°C]

Zeit [s]

Initiale Denaturierung Denaturierung

94 94

240 30

Annealing

Elongation

180

Finale Elongation

300

Anzahl Zyklen 1 30 1

Das PCR-Produkt wurde anschließend mittels einer NucleoSEQ-Säule aufgereinigt, nachdem diese für mindestens 30 min in 600 µl HPLC-H2O hydriert wurde. Der 20 µl Ansatz wurde komplett aufgetragen und die Säule 5 min bei 7000 U/min zentrifugiert. Es folgte eine Fällung des Durchflusses in Ethanol mit 0,1 M Natrium-Acetat (pH 4,5). Nach 15 min Inkubation bei RT und 20 min Zentrifugation bei 13000 U/min wurde der Überstand abgenommen und das DNA-Pellet mit 70%igem Ethanol gewaschen. Anschließend wurde erneut zentrifugiert, der Überstand abgenommen und das Pellet bei RT getrocknet, bevor es in 20-30 µl TSR bzw. Hi-DiTM Formamid aufgenommen wurde. Das DNAGemisch wurde letztendlich in ein Sequenzierungscap überführt, für 4 min bei 94 °C denaturiert und nach Abkühlung auf Eis in den Sequenzierer ABI PRISM 310 Genetic Analyser gestellt. Mittels des Programms ABI PRISM 310 Collection konnten Einstellungen zu Injektionszeit und Ablaufzeit eingestellt, sowie die Sequenzierung gestartet werden. Nach dem Ende des Durchlaufs konnten die Sequenzen mit Hilfe der Programme Sequencing Analysis v 3.4 und BioEdit ausgewertet werden.

Material und Methoden 4.2.1.9

Methoden der Klonierung von DNA-Sequenzen 4.2.1.9.1

Restriktionsenzym-Verdau

Restriktionsenzyme (bzw. Restriktionsendonukleasen) sind Bakterien-Enzyme, die DNA-Sequenzen an definierten Stellen schneiden können. Hierfür ist eine je nach Enzym spezifische Nukleotidabfolge (Restriktionsschnittstelle) notwendig. Der Schnitt der Doppelhelix kann abhängig vom Enzym grade (blunt) oder versetzt (klebrig) sein; bei Letzterem entstehen Basen-Überhänge. Dieses Prinzip wird verwendet, um künstlich DNA-Sequenzen in Plasmide klonieren zu können. Im Falle von klebrigen Enden müssen zu diesem Zweck DNA-Sequenz, als auch Plasmid mit identischen Enzymen geschnitten werden. Ein Standartansatz für einen einfachen Restriktionsenzymverdau eines Plasmids wurde folgendermaßen angesetzt: 30 µg Plasmid, 5-10 U Restriktionsenzym, gegebenenfalls 1 x BSA und 1 x entsprechender Restriktionsenzym-Puffer wurden mit HPLC-H2O auf 30 µl Endvolumen aufgefüllt. Der Ansatz wurde anschließend mindestens für 2 h bei 37 °C inkubiert und anschließend auf ein 1 %iges Agarosegel aufgetragen. Mittels Elektrophorese wurden die DNA-Sequenzen der Länge nach aufgetrennt und es konnte eine Geleluation des lineariserten Plasmides durchgeführt werden. Restriktionsenzymverdaue konnten auch mit 2 Enzymen gleichzeitig durchgeführt werden, wenn diese ähnliche Pufferbedingungen benötigten. Des Weiteren fand diese Methode Anwendung bei der Überprüfung der Transfektion. Hierfür wurden 5 µl einer Plasmidminipräparation in einem Endvolumen von 20 µl aufgenommen. 4.2.1.9.2

Ligation

Die enzymatische Verknüpfung einer DNA-Sequenz und einem linearisiertem Plasmid erfolgt entweder mit Hilfe einer DNA-Ligase oder nach dem Prinzip des TA Cloning®. Bei der Ligation mittels Ligase wurde in der vorliegenden Arbeit die T4-DNA-Ligase verwendet. Diese benötigt ATP als Kofaktor, um die Bildung einer Esterbindung zwischen einer freien OH-Gruppe am 3`-Ende des einen DNA-Stranges und einer Phosphatgruppe am 5`-Ende des anderen DNA-Stranges zu katalysieren. Für einen Ligationsansatz wurden 500 ng der zu klonierenden DNA-Sequenz, 100 ng linearisiertes Plasmid aus einer Plasmidpräparation, 1 x T4-DNA-Ligase-Puffer sowie 3 U T4-DNALigase in einem Reaktionsvolumen von 10 µl gemischt. Dieser Ligationsansatz wurde je nach verwendetem Plasmid über Nacht bei 14°C oder 1 h bei RT inkubiert und anschließend zur Transformation von Bakterien verwendet. TA Cloning® wird mit linearen Plasmiden durchgeführt, die am 3´-Ende je ein überhängendes dT, sowie eine covalent gebunde Topoisomerase besitzen, die eine spontane Ligation der Plasmid-Enden verhindert. Die zu klonierende Sequenz musste vor der Ligation mittels semi-quantitativer PCR unter Verwendung von Taq-Polymerase amplifierziert werden, wodurch dA-Überhänge am 5`-Ende entstanden. Diese Art der Ligation wird ohne vorhergehenden Restriktionsverdau und ohne DNALigase durchgeführt. Allein die terminalen Hydroxylgruppen der zu klonierende DNA Sequenz mit dAÜberhängen löst die Phosphotyrosyl-Bindung zwischen Plasmid und Topoisomerase auf. Die Topoisomerase wird abgetrennt und die Ligation erfolgt. In der vorliegenden Arbeit wurde TA Cloning® nach Angaben der jeweiligen Kit- Herstellers verwendet. 4.2.1.9.3

Transformation

Als Transformation wird die Aufnahme von DNA in kompetente Bakterien (meist E.coli) bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurde die Methode des Hitzeschocks angewandt, wobei durch eine kurzzeitige Temperaturerhöhung auf 42 °C die Membran der Bakterien porös gemacht wird, wodurch die DNA leichter eindringen kann. Zu diesem Zweck wurden 50 µl kompetente E.coli auf Eis aufgetaut und mit 2 µl Ligationsansatz vorsichtig vermischt. Nach einer 30minütigen Inkubation auf Eis wurde 44

Material und Methoden die Bakteriensuspension für 20-30 s einem Hitzeschock ausgesetzt. Nach kurzer Abkühlung auf Eis erfolgte die Zugabe von 250 µl SOC-Medium und die Inkubation bei 37 °C für 1,5 h im Schüttler. Anschließend wurden die Bakterien auf LB-Platten mit entsprechendem Selektionsantibiotikum (Ampicillin oder Kanamycin) – je nach vorhandener Resistenz des Plasmids – ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. 4.2.1.9.1

Übernachtkultur von Bakterien

Zur Vermehrung der Plasmide in Bakterien wurden einzelne Kolonien von LB-Platten gepickt und in 2 ml LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum überführt. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37 °C im Schüttler konnte mittels einer Mini-Präparation das Plasmid isoliert werden. Um größere Mengen an Plasmid zu gewinnen, wurden 200 ml-Übernachtkulturen angesetzt, wobei eine 4-6stündige Wachstumsphase der Bakterien in einer 2 ml-Vorkultur vorangegangen sein musste. 4.2.1.10

Klonierung für die Expression von SAA1 und SAA2

Um eine Expression von SAA1 und SAA2 in eukaryotischen Zellen forcieren zu können, musste zu Beginn die kodierende Sequenz Gene (siehe Abb. 7 und Abb. 8) in entsprechende Vektoren kloniert werden. Hierfür wurden die Sequenzen mittels der Primerpaare SAA1 Exp. s und as, sowie SAA2 Exp. s und as (siehe 4.1.5) in semi-quantitativen PCR-Ansätzen aus cDNA von hMSC amplifiziert. Bei der Wahl der Primer wurde darauf geachtet, dass sie das Stopp- und das Start-Codon einschließen; Letzteres sollte zusätzlich eine „starke“ Kozak-Sequenz umgeben. Diese Sequenz ist nach der Translation entscheidend für die adäquate Bindung von Ribosomen an die mRNA, wodurch die Proteinbiosynthese eingeleitet werden kann.

Abb. 7 Sequenz von SAA1, die für Klonierung in pcDNA sind grau unterlegt.

3.1/ V5-His TOPO® verwendet wurde. Start- und Stopp-Codon

Abb. 8 Sequenz von SAA2, die für Klonierung in pcDNA sind grau unterlegt.

3.1/ V5-His TOPO® verwendet wurde. Start- und Stopp-Codon

Material und Methoden Mittels des pcDNATM3.1/V5-His TOPO® Expression Kits wurden die codierenden Sequenzen von SAA1 und SAA2 in das linearisierte Plasmid pcDNATM 3.1/V5-His TOPO® nach der Methode des TA Cloning® ligiert. Die Transformation erfolgte in TOP10F´ E.coli mit anschließender Übernachtkultur und Präparation der Plasmid-DNA. Die Orientierung der DNA-Sequenzen von SAA1 und SAA2 im Vektor wurde mit einem BamHI-EcoRV-Verdau nachgewiesen. Anschließend wurde die vollständige SAA1- bzw. SAA2Sequenz mit Hilfe entsprechender Primer in 5´ → 3´ als auch in 3´ → 5´ Richtung sequenziert. Die in einer Maxi-Präparation gewonnene DNA von SAA1- und SAA2-pcDNATM3.1/V5-His TOPO® wurde einem SSP1-Verdau unterzogen und das mittels Agarosegel aufgereinigte, lineare Plasmid für die Transfektion von hMSC-TERT verwendet. 4.2.1.11

Präparation von Plasmid-DNA

Für die Gewinnung von Plasmid-DNA aus Bakterien wurden diese lysiert, und das Lysat mittels Silikasäulen und diverser Waschschritte aufgereinigt. 4.2.1.11.1

Mini-Präparation von Plasmid-DNA

Plasmid-Mini-Präparationen wurden mit Hilfe des NucleoSpin® Plasmid Kits von Macherey-Nagel nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Hierfür wurde je 1 ml Bakteriensuspension aus einer 2 mlÜbernachtkultur abzentrifugiert und das Pellet in einem RNase-haltigen Puffer A1 resuspendiert, um unerwünschte RNA zu verdauen. Anschließend erfolgte die Lyse der Bakterien in einem alkalischen, SDS-haltigen Puffer A2. Puffer A3 diente zur Neutralisierung des Lysats. SDS-Prezipitate und Zellreste wurden abzentrifugiert und der Überstand auf eine NucleoSpin® Plasmid Säule überführt. Die Plasmid-DNA konnte durch Zentrifugation an die Silikamembran der Säulen binden; Salze und andere Verunreinigungen wurden in anschließenden Waschschritten mit Ethanol-haltigem Puffer A4 eliminiert. Nach Trocknung der Säule, erfolgte die Eluation in 50µl Puffer AE. 4.2.1.11.2

Maxi-Präparation von Plasmid-DNA

Um große Mengen an Plasmid-DNA zu erhalten wurden Maxi-Präparationen mit dem NucleoBond®Xtra Maxi Kit nach Anleitung des Herstellers durchgeführt. Hierbei wurden 200 ml Bakteriensuspension pelletiert und in RNase-haltigem Puffer RES resuspendiert. Die Lyse erfolgte mittels des Puffer LYS, die Neutralisation wurde mit dem Puffer NEU durchgeführt. Das Gemisch wurde durch einen integrierten Filters von allen Zellbestandteilen gereinigt bevor es mittels der Silikamembran der NucleoBond®Xtra Säule filtriert wurde. Die Silikaembran dieser Säulen besteht aus hydrophilen Silkakügelchen, an die positiv geladene Methylaminoethanol-Gruppen gebunden sind. An diese Gruppen konnte die negativ geladene Plasmid-DNA während des Gravitations-betriebenen Durchflusses effektiv binden. Nach diversen Waschschritten wurde die Plasmid-DNA eluiert und anschließend mittels Isopropanol präzipitiert. Nach Zentrifugation wurde das Pellet mit 70 %igem Ethanol gewaschen, erneut pelletiert und getrocknet. Durch 60minütige Inkubation der Plasmid-DNA in 100 – 150 µl DNase-freiem H2O bei RT konnte das Pellet gelöst werden.

Material und Methoden

4.2.2

Zellbiologische Methoden

Alle nachfolgend beschriebenen Arbeiten mit eukaryotischen Zellen wurden unter einer Sterilbank mit sterilen Materialien und Chemikalien, sowie unter Verwendung von Latex-Handschuhen durchgeführt. 4.2.2.1

Isolierung von humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC)

Die Isolation von hMSC fand unter Einverständniserklärung der Patienten, sowie der Befürwortung der Lokalen Ethik Kommission der Universität Würzburg statt. Im Falle von nicht-osteoporotischen hMSC wurde den Patienten in der Orthopädie des König-Ludwig-Hauses aufgrund von Altersbedingter Arthrose oder Dysplasie ein Hüftkopf entfernt und durch eine Prothese ersetzt. Aus der dabei anfallenden Spongiosa des Hüftkopfes oder der Beckenpfanne wurden die hMSC nach dem leicht abgeänderten Protokoll von (Noth et al. 2002) isoliert. Das Alter der nicht-osteoporotischen Patienten mittleren Alter betrug 54,23 (± 8,86), alte Patienten waren durchschnittlich 77,29 (± 5,15) Jahre alt. Osteoporotische hMSC (hMSC-OP) wurden aus Hüftköpfen mit hüftnaher Niedrig-Energie-Fraktur isoliert, die wir aus der Klinik für Unfall-, Hand-, Plastische und Wiederherstellungschirurgie Würzburg erhalten haben. Neben dem hüftnahen Bruch durch Fall aus dem Stand diente als zweiter Osteoporoseindikator der Nachweis von Wirbelkörperfrakturen mittels Röntgenbild-Untersuchungen. Des Weiteren waren die Osteoporose-Patienten durchschnittlich 81,64 (± 7,94) Jahre alt. Spongiosa/Knochenmark des Beckenkammes, als auch Spongiosa, die zuvor aus Hüftköpfen mittels einer Pürette gekratzt werden musste, wurden in 50 ml-Röhrchen überführt und mit hMSC-Medium aufgefüllt. Es folgte eine Zentrifugation bei 1200 U/min für 5 min; der Überstand wurde abgenommen und die Röhrchen mit ca. 20 ml hMSC-Medium erneut befüllt. Durch kräftiges Schütteln wurden die hMSC aus den Trabekeln gelöst. Nach Absinken großer Knochenstücke wurde der Überstand in ein neues Röhrchen überführt. Diese Prozedur wurde zweimal wiederholt und die Zellen anschließend bei 5 min 1200 U/min abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und die Zellen in 20 ml hMSC-Medium resuspendiert. Es folgte eine Zellzählung und die Aussaat von ca. 1 x 109 Zellen pro 175 cm2-Flaschen in je 25 ml hMSC-Medium. Nach 3-4 Tagen im Brutschrank bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 %iger Luftfeuchtigkeit wurden nicht-adhärente Zellen (Erythrozyten, Leukozyten, Plasmozyten etc.) entfernt und die adhärente Zellen mit 1 x PBS gewaschen. Es folgten Mediumwechsel aller 3-4 Tage bis sich hMSC-Kolonien gebildet und den Boden der 175 cm2-Flaschen zu 60-80 % bedeckt hatten. Daraufhin konnte die Subkultivierung der hMSC in Passage 1 (P1) erfolgen. 4.2.2.2

Kultivierung von eukaryotischen Zellen

Die Kultivierung aller beschriebenen Zellarten fand in Brutschränken bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 %iger Luftfeuchtigkeit statt. Alle Kulturmedien enthielten 1 % Penicillin/Streptomycin, sowie 10 % Hitzeinaktiviertes FCS und wurden vor Gebrauch auf 37 °C erwärmt. Mediumwechsel erfolgten aller 3-4 Tage. Soweit nicht anders erwähnt, fand die Kultivierung in 75 cm2-Flaschen mit 15 ml von, der jeweiligen Zellart entsprechendem Expansionsmedium statt. Nach Erreichen von 70-90 % Konfluenz wurden die Zellen passagiert bzw. subkultiviert. Zu diesem Zweck musste das entsprechende Medium gründlich abgenommen und mögliche FCS-Reste durch Waschen in 1 x PBS entfernt werden. Die Zell-Zell-, sowie Zell-Substrat-Kontakte wurden mittels 2-5 min Inkubation in 1-2 ml 1 x Trypsin/EDTA (0,5 g/l) im Brutschrank aufgelöst. Das Trypsin wurde anschließend mit Kulturmedium inaktiviert und die Zellen vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren vereinzelt. In Röhrchen überführt, wurden die Zellsuspensionen von hMSC und HEK293 anschließend bei 1200 U/min 5 min zentrifugiert, die Überstände entfernt und die Zellen in entsprechendem Kulturmedium aufgenommen. Anschließend erfolgte die Aussaat der Zellen im Verhältnis 1:3 (hMSC) 47

Material und Methoden in neue Kulturflaschen oder – nach Bestimmung der Zellzahl – je nach Experiment benötigte Zellkulturgefäße. Humane MSC-TERT wurden nach der Inaktivierung von Trypsin nicht abzentrifugiert, sondern die Zellsuspension direkt 1:4 auf neue Flaschen bzw. andere Zellkulturgefäße verteilt. 4.2.2.3

Bestimmung der Zellzahl und Berechnung der Populationsverdopplung

Die Zellzahl wurde mittels einer Neubauer-Kammer bestimmt. Zu diesem Zweck wurden 30 µl der Zellsuspension nach 1 x Trypsin/EDTA Behandlung bzw. Resuspension mit 30 µl Trypanblau vermischt. 10 µl wurden auf eine Neubauer-Kammer aufgetragen und lebende Zellen (nicht blau gefärbt) wurden in 4 Quadraten gezählt. Der Mittelwert der Zellzahl aller 4 Quadrate wurde mit dem Verdünnungsfaktor 2 und 10 4 multipliziert, um die Anzahl an Zellen pro ml Zellsuspension zu erhalten. Die Populationsverdopplung (PD) wurde pro Passage folgendermaßen berechnet: PD = ln2(Anzahl lebender Zellen nach Ernte/ Anzahl lebender Zellen bei Aussaat). Da die Anzahl lebender hMSC bei Aussaat in P0 nicht bestimmbar ist, wurde der PD erst ab Aussaat in P1 festgehalten. Ebenso wurde kein PD für die letzte Passage (Px) bestimmt. Der Kumulative PD beschreibt die Anzahl an Pupulationsverdopplungen im Verlauf der Zeit. 4.2.2.4

In vitro-Alterung von hMSC

Für die in vitro-Alterung wurden hMSC aus Patienten ohne Osteoporose-Anzeichen ab P1 subkultiviert bis sie die seneszente Passage (Px) erreichten, in der innerhalb von 3 Wochen keine 7090 %ige Konfluenz erreicht wurde. In Px zeigten sich starke morphologische Veränderungen der Zellen; sie waren weitaus größer als in P1, abgeflacht und granulös. Es folgte der Abbruch der Kultivierung. Von P0 bis Px wurden hMSC in 3 x 75 cm2-Flaschen im Verhältnis 1:3, sowie Zellen für βGalaktosidase- und immuncytologische Färbungen ausgesät. In jeder Passage wurden Zellen für RNAund Proteinanalysen aus je einer der 3 Kulturflaschen isoliert. 4.2.2.5

Kryokonservierung von hMSC-TERT

Humane MSC-TERT wurden in 5-8 175 cm2-Flaschen expandiert und nach 70-90 % Konfluenz trypsiniert. Je mindestens 2 x 108 Zellen wurden mit 10 % hitzeinaktiviertem FCS und 10 % DMSO in Kryoröhrchen überführt und über Nacht bei -20 °C eingefroren. Am darauffolgenden Tag folgte die Überführung in -80 °C über Nacht, mit anschließender Konservierung in flüssigem Stickstoff. 4.2.2.6

Osteogene Differenzierung von hMSC und hMSC-TERT

Für die osteogene Differenzierung wurden 1 x 104 hMSC bzw. hMSC-TERT Zellen pro cm2 in 6-WellPlatten (für cytochemische Färbungen) und 25 cm2-Flaschen (für RNA-Isolation) in entsprechendem Kulturmedium ausgesät. Nach Erreichen der Konfluenz wurde das Medium durch osteogenes Differenzierungsmedium ersetzt; Medienwechsel fanden aller 3-4 Tage statt. Als Negativ-Kontrolle diente die Kultivierung in hMSC- bzw. hMSC-TERT-Medium. Die Dauer der osteogene Differenzierung variierte zwischen 5 Tagen und 4 Wochen (siehe Ergebnisse).

Material und Methoden 4.2.2.7

Applikation von rekombinantem, humanem SAA1 in der Zellkultur

Die Wirkung von Akute-Phase SAA auf die osteogene Differenzierung von hMSC und hMSC-TERT wurde durch Stimulation mit rekombinantem, humanem SAA1 (rhSAA1) untersucht. rhSAA1 ist ein Polypeptid aus 104 AS, dessen Sequenz – abgesehen von dem Austausch von zwei AS und dem Zusatz eines Methionins am N-Terminus – der Sequenz von SAA1α ohne N-terminalem Signalpeptid entspricht. Von hMSC in P1 (N = 4, Patienten: m, 47-70 Jahre alt) bzw. hMSC-TERT (N = 3) wurden 1 x 104 Zellen pro cm2 in 4-Well Leb-Tek Chamber Slides (für cytochemische Färbungen) und 6-Well-Platten (für RNA-Isolation) in entsprechendem Kulturmedium ausgesät. Nach Erreichen der Konfluenz wurde das Medium durch osteogenes Medium bzw. dem als Kontrolle dienendes Kulturmedium ersetzt. In je ein Well der osteogenen Differenzierung und der Kontrolle wurde kontinuierlich mit jedem Mediumwechsel 1 mM rhApo-SAA beigemischt. Nach 3 Wochen bzw. 10 Tagen wurde die osteogene Differenzierung von hMSC bzw. hMSC-TERT beendet. 4.2.2.8

Stabile Transfektion von hMSC-TERT

Je 1 x 106 hMSC-TERT Zellen wurden in hMSC-TERT-Medium ohne FCS mit je 10 µg SAA1- bzw. SAA2pcDNATM3.1/V5-His TOPO® Plasmid-DNA vermischt. Die Elektroporation erfolgte in 2 mm Elektroporationsküvetten bei 200 V und 950 µF in einem Gene Pulser® II. Anschließend wurden die Zellen in je zwei Wells einer 6-Well-Platte mit hMSC-TERTMedium ausgesät. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen durch Gabe von 100 µg/ml Neomycin selektiert. Die polyklonalen Zellklone wurden anschließend in einer starken Verdünnung (0,5 Zellen pro Well) in 96-Well-Platten ausgesät, um monoklonale Zellen herzustellen. Anschließend wurden die Zellen auf RNA-Ebene auf hohe SAA1- bzw. SAA1-Expression getestet. Für anschließende Experimente wurden je ein SAA1- und ein SAA2-hMSC-TERT-Klon mit der höchsten Expression ausgewählt; als Kontrolle dienten untransfizierte hMSC-TERT und mit pcDNATM3.1 (+) transfizierte hMSC-TERT (pcDNA-hMSC-TERT).

4.2.3

Protein-biochemische Methoden 4.2.3.1

Isolation von zellulärem Protein

Die Expression ausgewählter Gene wurde nicht nur auf mRNA-Ebene, sondern auch auf ProteinEbene untersucht. Hierfür wurden humane Zellen in 25 bzw. 75 cm2 ausgesät und nach Erreichen der Konfluenz 1 x mit kaltem 1 x PBS gewaschen. Alle folgenden Handhabungen wurden auf Eis durchgeführt, um Degradation der Proteine vorzubeugen. Der Zellmonolayer wurde in 300 µl Homogenisationspuffer mit Proteininhibitor (1:25) mit einem Zellschaber abgekratzt und in ein 1,5 ml 1,5ml-Reaktionsgefäß überführt. Zellmembranen und -bestandteile wurden mittels 20 s Sonifizierung bei 80 % zerstört. Nach Zentrifugation bei 4 °C und 10`000 rpm für 10 min konnte das Cytoplasma als Überstand abgenommen, aliquotiert und bei -20 °C gelagert werden. 4.2.3.2

Konzentrationsbestimmung von Proteinen

Zur Bestimmung der Konzentration von Proteinen wurde Roti®-Quant in einer 1:5 Verdünnung mit ddH2O verwendet. Roti®-Quant enthält den Farbstoff Coomassie brilliant Blue-G250, der unter Bindung von Proteinen von dem kationischen in den anionischen Zustand wechselt, der bei einer Wellenlänge von 595 nm gemessen werden kann. Die Absorptionsänderung ist dabei proportional zur Proteinmenge. Da Coomassie brilliant Blue-G250 vorzugsweise an basische Aminosäuren bindet, 49

Material und Methoden ist die Erstellung einer Standardkurve mittels BSA erforderlich. Hierfür wurden in Duplikaten 200, 500, 1000, 1500 und 2000 µg/ml BSA in UV-durchlässigen Küvetten mit 1 ml verdünnter Roti®-Quant Lösung gründlich vermischt und 15 min bei RT inkubiert. Ebenfalls in Duplikaten wurden je 10 µl der zu untersuchenden Proteinproben nach dem Selben Prinzip vorbereitet. Die Messung erfolgte bei 595 nm in einem Luminometer, wobei automatisch die Standardkurve berechnet und die Absorptionswerte der zu untersuchenden Proteine darauf bezogen wurden. 4.2.3.3

SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE)

Die SDS-Page ist eine Methode, mit der man denaturierte Proteine ihrem Molekulargewicht nach auftrennen kann. Die Denaturierung von Proteingemischen erfolgt durch Zugabe von reduzierendem β-Mercaptoehanol der anionischen Detergenz SDS. Letzteres zerstört Wasserstoffbrücken, wodurch sich die Tertiär- und Sekundärstrukturen der Proteine auflösen. Des Weiteren bindest SDS an die Disulfidbrücken der Aminosäuren, wodurch die nun linearisierten Proteine eine negative Ladung erhalten, die annähernd proportional zum Molekulargewicht ist. Beide Reagenzien sind in dem hier verwendeten Laemmli-Puffer (Laemmli 1970) enthalten. Polyacrylamidgele werden durch Polymerisation von Acrylamid und quervernetzendem N,N´Methylenbisacrylamid hergestellt. Anhängig von der Konzentration an Acrylamid kann die Porengröße und somit die Durchlässigkeit des Geles variiert werden. Die Polymerisation wird erst durch Zugabe von TEMED und APS initiiert. Die SDS-PAGE wird mit zwei unterschiedlichen Gelen durchgeführt, um eine saubere Auftrennung der Proteine zu gewährleisten. Zu Beginn passieren die Proteine ein weitporiges 4 %iges Sammelgel (pH 6,8) und werden erst im 12-15 %igem Trenngel (pH 8,8) aufgetrennt. Die beiden Gele wurden gemäß Tab. 7 hergestellt, wobei TEMED und APS immer zuletzt beigemischt wurde. Tab. 7 Zusammensetzung der Polyacrylamidgele für SDS-PAGE

Sammelgel Rotiphorese® Gel (40%) Acrylamid/ Bisacrylamid 1,5 M Tris-HCl pH 8,8 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 20 % SDS 10 % APS TEMED ddH2O

Trenngel 16 %

20%

5,2 %

16 %

20 %

0,125 M 0,1 % 0,05 % 3,44 mM Add a 10 ml

0,375 M 0,1 % 0,05 % 3,44 mM Add a 50 ml

Die angegeben Volumina waren ausreichend für ein Gel mit den Maßen 16 x 20 cm bzw. 2 Minigele je 7 x 10 cm. In eine Gelapparatur wurden 2 Glasplatten – durch entsprechende Spacer voneinander getrennt –, so eingespannt, dass der Boden, sowie die beiden Seiten wasserdicht verschlossen wurden. Daraufhin wurde das Trenngel eingefüllt und anschließend mit Isopropanol bedeckt. Nach der Polymerisation wurde das Isopropanol abgekippt und das Sammelgel gegossen. Ein Kamm wurde eingefügt, um entsprechende Taschen zu formen. Nach vollständiger Polymerisation wurde das Gel samt Glasplatten, Spacer und Klammern in eine Elektrophoresekammer überführt, und diese mit 1 x Laufpuffer befüllt. Je 10-30 µg Protein wurden zuvor 1:3 mit Laemmli-Puffer verdünnt und bei 100 °C im Wasserbad 10 min denaturiert. Pro Gel wurden immer identische Mengen an Protein aufgetragen, um 50

Material und Methoden Vergleichbarkeit zu gewährleisten. Die Proben wurden zusammen mit 10 µl des Protein-Marker unter Zuhilfenahme einer Hamilton-Spritze aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte im Falle von großen Gelen bei 150 V für 15 min und nach Erreichen des Trenngeles bei 300 V für 1 h, wobei die negativ geladenen Proteine zur positiven Anode wanderten. Bei Verwendung von Minigelen wurde eine Spannung von 110 V für 15 min und anschließend 200 V für 30 min angelegt. 4.2.3.4

Western-Blot

Western Blot ist eine Methode zum Übertragen von Proteinen auf eine Trägermembran, um anschließend über Immundetektion spezifische Proteine quantifizieren zu können. Die Übertragung der Proteine aus der SDS-PAGE auf eine PVDF-Membran erfolgte über das „semidry“-Verfahren. Diese Methode bedient sich erneut des Elektrophorese-Prinzips, wobei jedoch das elektrische Feld senkrecht zur ursprünglichen Laufrichtung aufgebaut wird, wodurch die negativ geladenen Proteine aus dem Polyacrylamidgel zur positiven Anode gezogen, und somit auf die darunter liegende Trägermembran übertragen werden. Zu diesem Zweck wurden Gel und Membran sandwichartig zwischen 2 Lagen Whatman-Papier und je eine Lage Schaumstoff eingeklemmt, die – angefeuchtet mit 1 x Transferpuffer – den Ionentransport zwischen den beiden Elektroden der Perfect Blue TM `Semi Dry‘-Blotter SedecTM M ermöglichen. In dem 1 x Transferpuffer enthaltenes Methanol dient dazu, das SDS von den Proteinen zu lösen, um eine effektive Bindung an die Trägermembran zu gewährleisten. Ein elektrisches Feld wurde mit 0,8 mA pro cm2 Gel aufgebaut. Die Effizienz des Western Blots wurde mittels Ponceau S nachgewiesen, indem die Trägermembran 10 min darin inkubiert und anschließend kurz mit H2O gewaschen wurde. Ponceau S färbt reversibel alle auf der Membran vorhanden Proteinbanden rötlich an. Unspezifische Bindungsstellen wurden daraufhin durch Inkubation der PVDF-Membran in Blocklösung für 1 h bei RT unter leichtem Schütteln abgeblockt. Die Immundetektion erfolgte ebenfalls in Blocklösung mit dem entsprechenden Primärantikörper über Nacht bei 4 °C. Nach 3 x 5 min Waschen in 1 x TTBS auf dem Schüttler wurde der Sekundärantikörper (gekoppelt an HRP) in einer 1 : 2000 Verdünnung in 1 x TTBS mittels eines 0,2 mm Filters filtrierte, und anschließend die Membran für 1 h bei RT auf dem Schüttler in dem Filtrat inkubiert. Nach erneutem Waschen für 3 x 5 min folgte die Detektion der gebundenen Antikörper mittels der AmershamTM ECLTM Western Blotting Detection Reagents I und II, die in dem Verhältnis 1:1 auf der Membran verteilt wurden. Das darin enthaltene Luminol wird durch die an den Sekundärantikörper gebundene HRP gespalten, wodurch es zu einer Lichtemission kommt, die mittels eines Röntgenfilms sichtbar gemacht werden kann. 4.2.3.4.1

Mehrfache Immundetektion von PVDF- Membranen

Die beim Western-Blot auf der PDVF-Membran gebundenen Antikörper können abgewaschen werden, um die Membran für weitere Immundetektionen zu verwenden. Zu diesem Zweck wurde nach der ECL-Behandlung die PVDF-Membran in 1 x TTBS gespült und in einer Glasschale mit 50 ml Stripping Buffer bedeckt. In einem Wasserbad wurde die Membran bei ca. 60°C für 30-90 min geschüttelt und anschließend erneut mit 1 x TTBS gespült. Die Membran konnte daraufhin wie in 4.2.3.4 beschrieben erneut mit der Blocklösung inkubiert und anschließend einer Immundetektion unterzogen werden werden. 4.2.3.5

Messung der Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase-Aktivität

Für Seneszenz-assoziierte β-Galaktosidase-Färbungen (SA-β-Gal-Färbung) wurden hMSC in 25 bzw. 75 cm2 -Flaschen ausgesät und nach Erreichen von 70-90% Konfluenz in 200µl 1 x PBS/0,1 % Triton lysiert. Es folgte die Sonifizierung analog der Proteinbehandlung (4.2.3.1) und nach Zentrifugation bei 130000 U/min bei 4 °C für 15 min wurde der Überstand abgenommen und einer Proteinmessung 51

Material und Methoden unterzogen (4.2.3.2). Es wurden pro Probe dreifache Ansätze mit je 10 µg Protein und 200 µl SA-βGal-Lösung in Wells einer 96-Well-Platte vermischt (Vacanti et al. 2005). Als Negativ-Kontrolle dienten 20 µl 1 x PBS in 200 µl SA-β-Gal-Lösung. Es folgte eine Inkubation über Nacht bei 37 °C ohne CO2 und anschließende Messung im Microplate-Reader bei OD405.

4.2.4

Cytochemische Färbungen

Vor jeder Fixierung wurden die Zellen 1 x mit 1 x PBS gewaschen. Alle Cytochemischen Färbungen wurden mit einem Axioskop 2, einer AxioCam MRC und dem Programm AxioVision 4.4.1.0 aufgenommen. 4.2.4.1

Seneszenz-assoziierte β-Galaktosidase-Färbung

Für Seneszenz-assoziierte β-Galaktosidase-Färbungen (SA-β-Gal-Färbung) wurden 100´000 Zellen auf 9,6 cm2-Petrischalen mit 21 x 26 mm Deckgläsern in entsprechendem Kulturmedium ausgesät und bis zu 50-70 % Konfluenz kultiviert. Anschließend erfolgte die Fixierung der Zellen in Formaldehyd/ Glutaraldehyd für 5 min. Die Lösung wurde abgenommen und die Petrischalen nach Abdampfen des Fixierers bei 4 °C gelagert. Für die in-vitro-Alterung erfolgte die Färbung von Zellen aus P1 bis Px (seneszente Passage) von hMSC eines Spender immer am selben Tag; als Negativ-Kontrolle dienten fixierte hMSC-TERT. Die Zellen wurden 1 x mit 1 x PBS gewaschen und 16 h in 1 ml β-GalaktosidaseFärbelösung bei 37 °C ohne CO2 inkubiert. Nach 3 x Waschen in dH2O folgte die Färbung der Zellkerne mit 1 ml Kernechtrot-Lösung für 2 min. Die mit Zellen behafteten Deckgläser wurden daraufhin kurz mit dH2O gespült und mit Glycerin-Gelatine auf Objektträgern fixiert. Positive Zellen wiesen eine Blaufärbung im Cytoplasma und einen rot gefärbten Kern auf. 4.2.4.2

Alizarin Rot S-Färbung

Für die Detektion von Kalciumhydrogenphosphaten in der Extrazellulären Matrix von Präosteoblasten/Osteoblasten wurde eine Färbung mit alkalischem Alizarin Rot S durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden die Zellen 10 min in eiskaltem Methanol fixiert, mit ddH2O gewaschen und 15 min in 1 ml 1 % Alizarin Rot S-Lösung inkubiert. Anschließend wurden die Zellen so oft in ddH2O gespült bis sich das Wasser nicht mehr verfärbte.

4.2.5

Immuncytochemische Färbungen

Für immuncytochemische Färbungen wurden 100`000 - 200`000 Zellen in 6- oder 12-Well-Platten mit 21 x 26 mm bzw. 18 mm Ø Deckgläsern ausgesät und nach Erreichen von 60-80 % Konfluenz wurden sie mit eiskaltem Methanol fixiert. Nach Lufttrocknung wurden die Zellen kurzzeitig bei 4 °C, längerfristig bei -20 °C gelagert. Alle folgenden Waschritte mit 1 x PBS (pH 7,2) wurden für je 5 min bei RT auf dem Schüttler durchgeführt. Nach 3 x Waschen wurde die Membran der Zellen mit 1 x PBS/0,05 % Tween-20 (pH 7,2) permeabilisiert. Es folgten zwei weitere Waschschritte mit anschließender Blockierung unspezifischer Bindungsstellen mittels 1 x PBS/1 % BSA (pH 7,2) für 30 min bei RT auf dem Schüttler. Nach erneutem Waschen folgte die Inkubation über Nacht bei 4 °C mit dem spezifisch gegen ein Protein gerichteten Primärantikörper in entsprechender Verdünnung in 1 x PBS/1 % BSA (pH 7,2). Am folgenden Tag wurde der Primärantikörper gründlich von den Zellen gewaschen und der Sekundärantikörper (gekoppelt an ein Fluorochrom) in entsprechender Verdünnung in 1 x PBS/1 % BSA (pH 7,2) 1-2 h bei 52

Material und Methoden RT abgedunkelt inkubiert. Nach 3 x Waschen wurden die Deckgläser mit den daran haftenden Zellen aus den Wells entnommen und mit Vectashield with DAPI (Kernfärbung) auf Objektträgern fixiert. Als Negativ-Kontrolle diente die Inkubation mit IgG-Proteinen in 1 x PBS/1 % BSA (pH 7,2) aus Tieren entsprechend des jeweiligen Primärantikörpers und identischer Konzentration zum Primärantikörper. Als weitere Spezifitätskontrolle wurden Zellen ausschließlich mit Sekundärantikörper inkubiert.

4.2.6

Mikroarray-Analysen 4.2.6.1

Microchip-Hybridisierung

Mittels Mikroarrays können mehrerer tausend Gene auf mRNA-Ebene gleichzeitig nachgewiesen werden. Mit dieser Methode lassen sich Unterschiede im Transkriptom, d.h. differentielle Genexpression zwischen verschiedenen Organismen oder Zelltypen aufdecken. Dafür muss mRNA gewonnen, in cDNA umgeschrieben und erneut in cRNA mit Biotinmarkierung transkribiert werden. Die biotinylierte cRNA wird schließlich fragmentiert und mit sogenannten Microchips hybridisiert. Auf Microchips sind tausende, synthetisch erstelle Oligonukleotide gebunden, die komplementär zu mRNA definierter Gene sind. Nach diversen Waschschritten folgt die Färbung der gebundenen, biotinylierten cRNA mit Streptavidin, an das ein Fluorochrom gekoppelt ist. Die Intensität der Fluoreszenzemission ist proportional zur Menge an gebundener cRNA und kann mittels eines Scanners und entsprechender Software ausgewertet werden. Für die vorliegenden Transkriptom-Analysen wurde zelluläre RNA von hMSC mehrerer Patienten unterschiedlichen Alters und Gesundheitszustands isoliert (siehe Tab. 8). Tab. 8 Für Microchip-Hybridisierung verwendete RNA-Proben

Bezeichnung

hMSC-K

hMSC-seneszent

hMSC-alt

hMSC-OP

Anzahl an RNA-Proben (N) Passage der hMSC Alter der Patienten in J. Osteoporose Geschlecht

5 P1 (x4), P2 (x1) Ø 57,5 ± 9,56 nein w (x4), m (x1)

5 Px Ø 56,4 ± 8,96 nein w (x3), m (x2)

4 P1 Ø 81,75 ± 4,86 nein w (x3), m (x1)

5 P1 (x4), P2 (x1) Ø 86,2 ± 5,89 ja w

Die RNA-Proben wurden mittels denaturierender Agarosegelelektrophorese vor der Verwendung hinsichtlich ihrer Qualität überprüft. Alle folgenden Schritte wurden von PD Dr. L. Klein-Hitpass am Institut für Zellbiologie, Genchip Labor an der Universität Duisburg-Essen durchgeführt. Die RNA-Proben der hMSC-K, hMSC-seneszent und hMSC-OP wurden mit den entsprechenden Kits nach dem Affymetrix GeneChip® Expression Analysis Protokoll (Version 2) in biotinylierte cRNA umgeschrieben. Die Synthese und Markierung der 4 verschiedenen cRNA-Proben von hMSC-alt wurden mit dem Affymetrix GeneChip®3´IVT Express Kit durchgeführt. Alle Proben wurden auf je einem GeneChip HG-U 133 Plus 2.0 hybridisiert. Auf diesen Microchips sind Oligonukleotide für über 54´000 Probesets gebunden, die wiederum 47´400 Transkriptvarianten bzw. 38´500 Genen entsprechen. Hybridisierung, Waschen und Färben der Microchips wurde nach dem Affymetrix GeneChip® Expression Analysis Protokoll (Version 2) durchgeführt. Die Hybridisierungssignale wurden mit dem GeneChip Scanner 3000 detektiert und mit der GeneChip Operating Software 1.2 analysiert. Bei allen Hybridisierungen wurden Hybridisierungs-Kontrollen zur cRNA gegeben, um die Werte verschiedener Chips normalisieren zu können.

Material und Methoden 4.2.6.2

Statistische Auswertung von Mikroarray-Daten

Die Normalisierung der Daten wurde von PD Dr. L. Klein-Hitpass vorgenommen, die TranskriptomVergleiche von hMSC-K mit hMSC-seneszent, hMSC-alt bzw. hMSC-OP wurden mit „Significance Analysis of Mikroarrays“ (SAM) nach (Tusher et al. 2001) berechnet. Nur jene Probesets – bzw. Genprodukte – die in mindestens einer der beiden hMSC-Gruppen der jeweiligen Vergleiche (hMSC-K versus hMSC-seneszent, hMSC-K versus hMSC-alt bzw. hMSC-K versus hMSC-OP) in mindestens 50% der RNA-Proben exprimiert waren (= „present“), wurden weiter analysiert. Differentielle Genexpression wurde durch folgende Kriterien definiert: Der Foldchange (FC), also die Stärke der Genexpressionsänderung zwischen zwei Vergleichsgruppen musste < 0,667 für erniedrigte Expression und > 1,5 für erhöhte Expression betragen, dies entspricht einer 1,5fachen Genexpressionsänderung im Vergleich zu hMSC-K. Zusätzlich wurden nur jene FC als aussagekräftig betrachtet, deren q-Wert < 10 % betrug. Dieser Wert bezeichnet die Falscherkennungsrate in Prozent, die sich wiederum aus den Daten von 500 Permutationen zusammen setzt. Die Zuordnung in Gene-Ontologie (GO)-Gruppen erfolgte mittels GOstat mit der Benjamini und Hochberg Berechnung(Benjamini and Hochberg 1995). Als Referenzliste dienten all jene Probesets, die mindestens in einer der beiden Vergleichsgruppen in mindestens 50% der hMSC RNA-Proben als „present“ detektiert wurden. Nur jene GO-Gruppen galten als überrepräsentativ häufig vorkommend, die nach der Benjamini und Hochberg Berechnung einen p < 0,1 aufwiesen und mindestens 4 Gene umfassten. Um die Aussagekraft der Ergebnisse zu erhöhen wurden nur jene GO-Gruppen in der vorliegenden Arbeit aufgeführt, denen in der Referenzliste weniger als 200 Gene zuzuordnen waren. Die Generierung von Heatmaps wurde ebenfalls von PD Dr. L. Klein-Hitpass mit dem Programm Spotfire DecisionSite for Functional Genomics 9.1.1 durchgeführt.

Ergebnisse

5 Ergebnisse

5.1 Mikroarray-Analysen 5.1.1

Aufarbeitung der Mikroarray-Daten

Von den möglichen 54´000 Genprodukten, die mittels der Microchips von Affymetrix hätten detektiert werden können, zeigten mindesten die Hälfte in allen hMSC ein positives Hybridisierungssignal. Bevor diese Datenmengen nach anschließendem Vergleich zweier hMSC-Gruppen mittels SAM (Bsp. hMSC-alt versus hMSC-K) systembiologisch ausgewertet werden konnten, musste die Verlässlichkeit der Daten beachtet werden. A hMSC-K

hMSC-alt

B hMSC-K

hMSC-alt

D hMSC-K

hMSC-alt

hMSC-K

hMSC-alt

E hMSC-K

q < 10%

q < 10%, FC > 1,5fach

hMSC-alt

q < 10%, FC > 2fach

q < 20%

Abb. 9 Heatmap der Mikroarray-Hybridisierungssignale von Probsets mit Relevanz im NOTCH-Signalweg in hMSC-K und hMSC-alt. Dargestellt sind die Hybridisierungssignale der 4 MSC-alt-, sowie der 5 hMSC-K-Populationen für alle NOTCHrelevanten Probesets (93), die in der SAM (hMSC-alt/hMSC-K) detektiert werden konnten ohne stringente Einschränkungen (A). Der „fold-change“ (FC) variierte dabei zwischen 0,111 (oben) und 4,545 (unten). Der q-Wert schwankte je nach Probeset zwischen 0% und maximal 60,31%. Im Anhang sind alle Probesets mit FC, q-Wert und Hybridisierungssignal ausführlich aufgelistet (Tab. 19). Nach Abzug aller Probesets mit q ≥ 20% blieben 45 Genprodukte übrig (B). Die Eingrenzung auf q 1,5 bzw. < 0,667 entsprechend Mikroarray-Ergebnissen (+) FC(ØhMSC-alt/ØhMSC-K) 1,5-1,2 bzw. 0,667-0,8 entsprechend Mikroarray-Ergebnissen — keine Übereinstimmung

Ergebnisse Die Abb. 12 zeigt deutlich die unterschiedliche Expression der ausgewählten Gene in hMSC-K und hMSC-alt, wobei auffällig ist, dass die Standardabweichung in den hMSC-K in allen 11 PCR-Analysen deutlich geringer ist, verglichen mit hMSC-alt. Nach Berechnung des „fold change“ (FC= ØhMSC-alt/ØhMSC-K) zeigte sich, dass bei 4 der 11 Gene der FC > 1,5 betrug (Tab. 9). Weitere 3 Gene wiesen einen FC ≥ 1,2 auf, und zeigen dadurch eine deutliche Tendenz zur erhöhten Expression in hMSC-alt, die der SAM entspricht. Nur bei den 4, laut SAM in hMSC-alt geringer exprimierten Genen konnte keine Übereinstimmung mit den PCR-Analysen gefunden werden. Allein MMP3 zeigt eine leichte Tendenz zur verringerten Expression, die aufgrund der hohen Standardabweichung in hMSC-K als nicht zuverlässig angesehen wird. Damit lassen sich die Mikroarray-Ergebnisse zur in-vitro-Alterung von hMSC trotz der Verwendung eines neuen Pools an hMSC-K zu 58,33% bestätigen. Die anhand der Standardabweichung ersichtliche interindividuelle Variabilität der Genexpression innerhalb einer Untersuchungsgruppe, z.B. hMSC-K, konnte auch in den Mikroarray-Hybridisierungen nachgewiesen werden, verdeutlicht an einer Heatmap (Abb. 13).

Vergleich der Genexpression von hMSC-K mit hMSC-alt

Genexpression in Prozent [%]

250

200

Ø hMSC-K

150

Ø hMSC-alt 100

Abb. 12 Graphische Darstellung der Ergebnisse aus Tab. 9 zur biologischen Evaluierung der Mikroarray-Ergebnisse zur invivo-Alterung von hMSC mittels semi-quantitativer PCR und Densitometrie. Angegeben sind die Mittelwerte der densitometrischen Berechnung zur relativen Genexpressionsstärke der einzelnen Gene in hMSC-alt (ØhMSC-alt) und hMSCK (ØhMSC-K) nach Normalisierung auf das Haushaltsgen EEF1A1 (eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1). Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.

Ergebnisse

hMSC663

hMSC606

hMSC520

hMSC353

hMSC296

hMSC295

hMSC247

hMSC276

hMSC559

hMSC-alt

hMSC-K

Abb. 13 Heatmap der Mikroarray-Hybridisierungssignale von hMSC-K und hMSC-alt. Farblich dargestellt sind die Hybridisierungssignale der 4 MSC-alt-, sowie der 5 hMSC-K-Populationen für alle Probesets der für die semi-quantitative PCR ausgewählten Gene. Je Probeset wurde ein Mittelwert gebildet (schwarz); der hellste Rotton markiert ein 4fach höheres Hybridisierungssignal im Vergleich zum Mittelwert, der hellste Grünton ein 4fach geringeres Signal.

5.1.3

Mikroarray-Analysen von seneszenten hMSC 5.1.3.1

Differentielle Genexpression in seneszenten hMSC

Genomanalysen von hMSC-seneszent und hMSC früher Passagen (hMSC-K) wurden mittels Microchip Hybridisierungen durchgeführt. RNA von hMSC von jeweils 5 Spendern mittleren Alters (hMSC-K: Ø 57,6±9,56 Jahre, hMSC-seneszent: Ø 56,4±8,96 Jahre) wurde isoliert und die Proben mit den GeneChips HG-U 133 Plus 2 hybridisiert. Die Auswertung der Daten ergab, dass 25716 Genprodukte in hMSC-seneszent und/oder hMSC-K exprimiert werden. Verglichen mit hMSC-K sind 1284 dieser Genprodukte in hMSC-seneszent mindestens 1,5fach höher exprimiert und 2477 Genprodukte mindestens 1,5fach geringer exprimiert (Abb. 14).

Abb. 14 Venn-Diagramm der Mikroarray-Ergebnisse zur differentiellen Genexpression in seneszenten hMSC nach Vergleich mit hMSC-K. Angegeben ist die Anzahl der höher exprimierten Genprodukte (rot), bzw. der geringer exprimierten Genprodukte (grün) in hMSC-seneszent.

Ergebnisse 5.1.3.2

Statistische, funktionelle Analyse mittels GOstat

Die in seneszenten Zellen 1,5fach höher bzw. 1,5fach geringer exprimierten Genprodukte wurden mittels GOstat hinsichtlich ihrer Funktion in den Hauptkategorien Biologischer Prozess, Molekulare Funktion und Zelluläre Komponente untersucht. Als Referenzliste dienten die 25716 Genprodukte, die in hMSC-seneszent und/oder hMSC-K exprimiert wurden. In der Kategorie Biologischer Prozess wurden für höher exprimierte Gene in hMSC-seneszent keine überrepräsentativ häufigen GO-Gruppen detektiert. Geringer exprimierte Gene hingegen konnten der Mitose und der Regulation des Zellzyklus zugeordnet werden (Abb. 15). In der Kategorie Zelluläre Komponente sind Spindel-, Mikrotubuli und Replikations-assoziierte Gene geringer exprimiert und Gene für die Zellausdehnung, sowie Integrine und Rezeptoren (z.B. ITG-Rezeptoren, TGFBR2) höher exprimiert. Ausschließlich höher exprimierte Gene wurden der negativen Regulation von Kinase- und Transferaseaktivität in der Kategorie Molekulare Funktion zugeordnet. Die in den jeweiligen GO-Gruppen detektierten Gene, sowie deren exakte Anzahl sind im Anhang aufgelistet (Tab. 23, Tab. 24).

Überrepräsentierte GO-Gruppen der differentiellen Genexpression in hMSCseneszent Regulation von Transferaseaktivität Negative Regulation von Transferaseaktivität

Molekulare Funktion

Negative Regulation von Kinaseaktivität Regulation von Cyklin-abhängiger Proteinkinase-Aktivität Spindel

GO-Gruppen

Spindelpol Zentrosom Kinetochor Mikrotubuli Mikrotubuli-organisierendes Zentrum Microtubuli-assoziierter Komplex

Zelluläre Komponente

Spindelmikrotubuli Nukleares Chromosom Replikationsgabel Integrinkomplex Zyklin-abhängiger Proteinkinase-Holoenzym-Komplex Spannungsabhängiger Kaliumkanalkomplex Rezeptorkomplex Punktuelle Zellausdehnung Zellausdehnung

Biologische Funktion

Zellzyklus-Checkpoint Regulation von Mitose

verringerte Genexpression

20%

40%

60%

80%

100%

Anzahl Gene in Prozent

erhöhte Genexpression

Abb. 15 Überrepräsentierte Gene Ontologie (GO)-Gruppen der differentiell exprimierten Genprodukte in hMSCseneszent beim Vergleich mit hMSC-K. Die 1,5fach höher bzw. geringer expimierten Genprodukte der MikroarrayErgebnisse zu hMSC-seneszent versus hMSC-K wurden mittels GOstat hinsichtlich ihrer Funktion untersucht. Als Referenzliste dienten dabei die 25716 Genprodukte, die in hMSC-seneszent und/oder hMSC-K exprimiert werden. Als 100% ist jeweils die Anzahl an Gene pro Gruppe, die überhaupt in hMSC exprimiert werden, dargestellt. Den jeweiligen Anteil daran, der überrepräsentativ häufig in den differentiell exprimierten Genen auftritt, ist farblich markiert: für erhöhte Genexpression in hMSC-seneszent: rote Balken, geringere Genexpression in hMSC-alt: grüne Balken.

Ergebnisse 5.1.3.3

Biologische Evaluierung der Mikroarray-Ergebnisse zur Seneszenz

Die Allgemeingültigkeit der Mikroarray-Ergebnisse wurde mittels semi-quantitativer PCR an hMSC 5 weiterer Spender biologisch untersucht. Die RNA wurde aus P1 und Px (seneszente Passage) isoliert. Auf mRNA-Ebene wurde die Expression von 32 Genen untersucht, die in den Auswertungen der Mikroarray-Analysen mindestens 1,5fach erhöhte bzw. erniedrigte Expression aufwiesen. Nach densito-metrischer Auswertung der PCR und Normalisierung auf ein Haushaltsgen wurden die relativen Genexpressionsänderungen (FC = Px/P1) ermittelt, soweit möglich. Bei 26 Genen, und somit 81,25% aller untersuchten Gene, konnten die Mikroarray-Ergebnisse durch die PCR-Analysen bestätigt werden (Tab. 10). In Einzelfällen konnten jedoch keine PCR-Banden in einigen hMSC-Populationen detektiert werden (n.e.), in anderen Fällen konnte nur in einer der beiden Vergleichsgruppen eine Expression detektiert werden. Dies deutet auf induzierte bzw. exklusive Expression des entsprechenden Gens hin. CENPM, TK1, RUNX3, ESR1, CD24 und HMMR zeigen in mindestens einer hMSC-Population eine exklusive Expression in P1 auf (↓), während CA2, FGFR2 und SOX11 sogar in 3-5 hMSC-Populationen exklusiv in P1 expimiert werden und keine Expression in Px aufweisen. PSG1 und GPR116 zeigen exklusive Expression in Px (↑) in 2 hMSCPopulationen, NR3C2, CDH1 und CDKN2A sogar in 3-5 Populationen. Gene, von denen einzelne Probesets einen q-Wert > 10% aufwiesen, konnten ebenfalls bestätigt werden. Zum Teil wurden durch die PCR-Analyse und Densitometrie extreme Unterschiede in der Höhe der Genexpression zwischen den hMSC verschiedener Spender detektiert, z.B. für IGFBP5 oder HELLS. Diese Spendervariabilitäten der untersuchten Gene lassen sich ebenfalls in den MikroarrayAnalysen beobachten, verdeutlicht an einer Heatmap (Abb. 16). Tab. 10 Biologische Evaluierung der Mikroarray-Ergebnisse zu seneszenten hMSC mittels semi-quantitativer PCR und Densitometrie

Mikroarray-Analyse

Gen Symbol

Gen Name

Probeset-ID

COL10A1

collagen, type X, alpha 1

205941_s_at 217428_s_at

COL14A1

collagen, type XIV, alpha 1

212865_s_at

CENPM

centromere protein M

218741_at

CCNB1

cyclin B1

DHFR

dihydrofolate reductase

PTGS2

prostaglandinendoperoxide synthase 2

HELLS

helicase, lymphoid-specific

CA2

carbonic anhydrase II

209301_at

TGFB2

transforming growth factor, beta 2

209908_s_at 209909_s_at 220407_s_at 228121_at

SPP1

secreted phosphoprotein 1

209875_s_at

TK1

thymidine kinase 1, soluble

RUNX3

runt-related transcription factor 3

214710_s_at 228729_at 202532_s_at 202533_s_at 202534_x_at 48808_at 1554997_a_at 204748_at 220085_at 223556_at 227350_at

1554408_a_at 202338_at 204197_s_at 204198_s_at

FC (hMSCseneszent/ hMSC-K)

q (%)

0,30 0,23 0,25

2,70 1,61 9,54

0,04 0,11 0,09 0,47 0,41 0,47 0,41 0,33 0,45 0,19 0,31 0,28 0,02 0,28 0,35 0,31 0,36 0,47 0,14 0,12 0,26 0,33

0,00 0,00 0,00 0,72 1,99 0,00 0,34 2,43 7,00 0,50 1,02 0,00 1,61 4,84 1,61 1,02 1,02 7,00 0,00 0,00 1,02 4,84

Analyse der semi-quantitativen PCR NSpender mit FC (Px/P1) >1,5 bzw. 1,5 aufwiesen (FC = hMSC-seneszent/hMSC-K). Der q-Wert betrug < 20%. Semi-quantitative PCR wurde mit 5 weiteren hMSC-Populationen durchgeführt und die Ergebnisse – soweit möglich – densitometriert. Die Daten wurden auf das Haushaltsgen EEF1A1 (eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1) normalisiert. Die relative Genexpression der einzelnen hMSC wurde berechnet (FC = hMSC seneszente Passage (Px)/hMSC Passage 1 (P1)) und die Anzahl (N) der Spender, deren FC > 1,5 bzw. < 0,667 betrug, aufgezählt. Wenn in einer hMSC-Population weder in P1 noch in Px eine Genexpression detektierbar war, galt dieses Gen als nicht exprimiert (n.e.). Die densitometrische Auswertung war ebenfalls nicht möglich, wenn in einer der beiden Passagen einer hMSCPopulation kein Amplikon eines Gens nachzuweisen war. Im Falle einer fehlenden Expression in P1 galt dann dieses Gen als exklusiv exprimiert in Px (↑), bei fehlender Expression in Px galt das Gen als exklusiv exprimiert in P1 (↓). Die Ergebnisse der semi-quantitativen PCR wurden folgendermaßen bewertet (hMSC-Populationen mit n.e. wurden nicht in die Bewertung einbezogen): +++ wenn in mindestens der Hälfte der hMSC-Populationen exklusive Expression vorliegt (↓ oder ↑) ++ wenn in mindestens der Hälfte der hMSC-Populationen der FC(Px/P1) ≥ bzw. ≤ FC(hMSC-seneszent/hMSC-K) ist + wenn in mindestens der Hälfte der hMSC-Populationen der FC(Px/P1) > 1,5 bzw. < 1,667 ist — wenn in mindestens der Hälfte der hMSC-Populationen keine Übereinstimmung mit der Mikroarray-Analyse vorliegt

Ergebnisse

hMSC276

hMSC277

hMSC271

hMSC278

hMSC353

hMSC296

hMSC295

hMSC247

hMSC276

hMSC274

hMSC-seneszent

hMSC-K

Abb. 16 Heatmap der Mikroarray-Hybridisierungssignale von hMSC-K und hMSC-seneszent. Farblich dargestellt sind die Hybridisierungssignale der 5 MSC-seneszent-, sowie der 5 hMSC-K-Populationen für alle Probesets der für die semiquantitative PCR ausgewählten Gene. Je Probeset wurde ein Mittelwert gebildet (schwarz); der hellste Rotton markiert ein 4fach höheres Hybridisierungssignal im Vergleich zum Mittelwert, der hellste Grünton ein 4fach geringeres Signal.

Ergebnisse

5.1.4

Mikroarray-Analysen von Osteoporotischen hMSC 5.1.4.1

Differentielle Genexpression in hMSC-OP

Humane hMSC wurden hinsichtlich ihrer Bedeutung für die Osteoporose untersucht, indem das Transkriptom von hMSC aus Osteoporose-Patienten mit dem Transkriptom von hMSC aus Spendern ohne Osteoporose verglichen wurde. Zu diesem Zweck wurden die Mikroarray-Hybridisierungen der 5 hMSC-K aus Spendern mittleren Alters (Ø57,6 ± 9,56 Jahre) mit Hilfe von SAM mit den Hybridisierungen von hMSC-OP von 5 Frauen (Ø 86,2 ± 5,89 Jahre alt) mit Osteoporose-Merkmalen (Hüftbruch durch Fall aus dem Stand und Wirbelkörperfrakturen) verrechnet. Die SAM-Berechnungen zeigten, dass 25158 Probesets bzw. Genprodukte in hMSC-K bzw. hMSC-OP exprimiert werden. Davon wiesen bei einem q-Wert < 10 % 1574 Genprodukte einen FC >1,5 und 1135 Genprodukte einen FC < 0,667 und damit eine 1,5fach erniedrigte Genexpression in hMSC-OP auf (Abb. 17).

Abb. 17 Venn-Diagramm der Mikroarray-Ergebnisse zur differentiellen Genexpression in hMSC-OP aus OsteoporosePatienten nach Vergleich mit hMSC-K. Angegeben ist die Anzahl der höher exprimierten Genprodukte (rot), bzw. der geringer exprimierten Genprodukte (grün) in hMSC-seneszent. B: Anzahl differentiell exprimierter Genprodukte in hMSCOP nach Abzug der Alterungsgene aus den Mikroarray-Analysen zur in-vivo-Alterung von hMSC (hMSC-alt versus hMSCK).

5.1.4.2

Statistische, funktionelle Analyse mittels GOstat

Die Funktion der differentiell exprimierten Gene in hMSC-OP wurde mittels einer GOstat-Analyse statistisch bestimmt. Die 1574 Probesets der erhöhten Expression bzw. die 1135 Probesets der erniedrigten Genexpression wurden in dem GOstat-Online-Tool mit den 25158 Probesets, die in hMSC-K bzw. hMSC-OP überhaupt exprimiert werden, verglichen. In der Hauptkategorie Molekulare Funktion wurden keine GO-Gruppen überrepräsentiert häufig detektiert. Jedoch zeigte sich, dass Gene für die korrekte Funktion der Spindel, der Replikation und des Proteasoms bei Osteoporose in hMSC geringer exprimiert werden (Abb. 18). Auch Mikrotubuliaktivität und die Mitose sind negativ beeinflusst. Im Gegensatz dazu exprimieren hMSC-OP Kollagene und Gene für Fokale Adhäsionsproteine überrepräsentativ häufig höher. Auch Genprodukte mit Funktion in der Regulation der Lokomotion, Angiogenese und Sekretion sind höher exprimiert. Aufgrund der erhöhten Expression vieler Wachstumsfaktoren (TGFB1, HBEGF, VEGFB, PDGFA, siehe Anhang) ist die Proliferation von hMSC-OP entsprechend der GOstat-Analyse positiv reguliert.

Ergebnisse

Überrepräsentierte GO-Gruppen der differentiellen Genexpression in hMSC-OP Spindel Kinetochor Mikrotubuli-assoziierter Komplex Spindelmikrotubuli

Zelluläre Komponente

Kondensierte Chromosomen Spliceosom Replisom

GO-Gruppen

Nukleäre Replikationsgabel Proteasom-Komplex Kollagen Fokale Adhäsion Zellzyklus-Checkpoint Regulation der Mitose Positive Regulation der Proliferation Regulation der Sekretion

Biologischer Prozess

Regulation der B-Zell-Aktivität Regulation der Angiogenese Regulation der Zellmotilität Positive Regulation der Lokomotion Regulation der MAPKKK-Kaskade

veringerte Genexpression erhöhte Genexpression

20%

40%

60%

80%

100%

Anzahl Gene in Prozent

Abb. 18 Überrepräsentierte Gene Ontologie (GO)-Gruppen der differentiell exprimierten Genprodukte in hMSC-OP beim Vergleich mit hMSC-K. Dargestellt sind die mindestens 1,5fach höher bzw. geringer exprimierten Genprodukten der Mikroarray-Ergebnisse zu hMSC-OP versus hMSC-K. Als Referenzliste dienten dabei die 25158 Genprodukte, die in hMSCOP und/oder hMSC-K exprimiert werden. Als 100% ist jeweils die Anzahl an Gene pro Gruppe, die überhaupt in der Referenzliste exprimiert werden, dargestellt. Den jeweiligen Anteil daran, der überrepräsentativ häufig in den differentiell exprimierten Genen auftritt, ist farblich markiert: für erhöhte Genexpression in hMSC-OP: rote Balken, geringere Genexpression in hMSC-OP: grüne Balken.

5.1.4.3

Biologische Evaluierung der Mikroarray-Ergebnisse zur Osteoporose

Die Mikroarray-Ergebnisse wurden mittels semi-quantitativer PCR und anschließender Densitometrie evaluiert. Zu diesem Zweck wurden 11 Gene herausgesucht, deren Probesets laut SAM in hMSC-OP versus hMSC-K mindestens 1,5fach höher bzw. geringer exprimiert waren. Der q-Wert betrug in mindestens einem Probeset pro Gen weniger als 10%. Für die Evaluierung konnten nur 4 der 5 hMSC-OP-Population verwendet werden, die ebenfalls für die Mikroarray-Hybridisierungen herangezogen wurden. Als Kontrolle diente ein neuer Pool an hMSC aus 9 verschiedenen Patienten mittleren Alters (Ø = 47 ± 5,32 Jahre), wodurch es sich im Folgenden nicht um eine technische, sondern eine biologische Evaluierung der SAM-Ergebnisse handelt. Die Abb. 19. zeigt deutlich die unterschiedliche Expression der ausgewählten Gene in hMSC-OP und hMSC-K, wobei auffällig ist, dass die Standardabweichung in den hMSC-K oft deutlich geringer ist, verglichen mit hMSC-OP. Nach Berechnung des „fold change“ (FC= ØhMSC-OP/ØhMSC-K) zeigte sich, dass bei 5 der 11 Gene der FC > 1,5 bzw. < 0,667 war, dies entspricht einer 1,5fachen Genexpressionsänderung in hMSC-OP im Vergleich zu hMSC-K (Tab. 11). Weitere 2 Gene wiesen einen FC ≥ 1,2 bzw. < 0,8 auf, und zeigen dadurch eine deutliche Tendenz zur erhöhten bzw. erniedrigten Expression in hMSC-OP, die der SAM entspricht. Bei den PCR-Analysen der restlichen 4 Gene, deren Probesets in der SAM nur einen FC von 1,55 – 2,5 bzw. 0,5 aufwiesen, wurde keine differentielle Expression detektiert bzw. war im Falle von HELLS die Standardabweichung zu groß, um den FC(ØhMSC-OP/ØhMSC-K) von 0,82 als signifikant 66

Ergebnisse anzusehen. Damit lassen sich die Mikroarray-Ergebnisse zu osteoporotischen hMSC trotz der Verwendung eines neuen Pools an hMSC-K zu 63,63% bestätigen. Die anhand der Standardabweichung ersichtliche Variabilität der Genexpression innerhalb einer Untersuchungsgruppe, z.B. hMSC-K, konnte auch in den Mikroarray-Hybridisierungen nachgewiesen werden, verdeutlicht an einer Heatmap (Abb. 20). Tab. 11 Biologische Evaluierung der Mikroarray-Ergebnisse zu osteoporotischen hMSC mittels semi-quantitativer PCR und Densitometrie Mikroarray-Analyse

Analyse der semi-quantitativen PCR

Gen Name

Probeset-ID

FC (hMSCOP/ hMSC-K)

TGFB1

transforming growth factor, beta 1

203085_s_at

2,04

3,90

VEGFA

vascular endothelial growth factor A

WNT5B

wingless-type MMTV integration site family, member 5B

COL10A1

collagen, type X, alpha 1

PTH1R MAB21L2

parathyroid hormone 1 receptor mab-21-like 2

IBSP

integrin-binding sialoprotein

SOST

sclerostin

HELLS

helicase, lymphoid-specific

CNTN3

contactin 3

210512_s_at 210513_s_at 211527_x_at 212171_x_at 221029_s_at 223537_s_at 230299_s_at 205941_s_at 217428_s_at 205911_at 210302_s_at 210303_at 207370_at 236028_at 223869_at 220085_at 223556_at 227350_at 229831_at 204337_at

1,55 2,16 2,47 2,07 1,61 2,22 1,55 5,25 4,00 3,00 6,94 14,43 4,82 5,72 7,30 0,23 0,53 0,32 0,13 0,28

20,86 3,90 2,46 6,30 10,25 3,21 14,24 0,00 0,62 2,70 0,00 0,00 0,90 0,00 2,18 1,40 8,24 4,93 1,60 5,70

Gen Symbol

regulator of G-protein signaling 4

q (%)

FC STABW STABW (ØhMSC-OP [%] von [%] von /ØhMSC-K) ØhMSC-K ØhMSC-OP

Übereinstimmung mit Array

0,99

22,25

17,37

— +

1,01

16,79

5,25

—

0,89

27,22

4,15

—

1,23

17,55

19,14

(+)

2,05

55,73

39,73

3,13

56,77

32,23

+ +

2,22

59,53

53,01

2,95

87,48

8,99

0,82

68,29

93,83

—

0,50

65,07

67,45

0,70 28,58 50,82 204338_s_a 0,20 4,38 (+) t 204339_s_a 0,25 5,70 t Gelistet sind alle exprimierten Probest-IDs von 11 Genen, die beim Vergleich von hMSC-OP mit hMSC-K mittels SAM einen „fold change“ (FC) < 0,667 bzw. > 1,5 aufwiesen (FC = hMSC-OP/hMSC-K). Der q-Wert betrug mindestens in einem Probeset ≤ 10%. Semi-quantitative PCR wurde mit 4 für den Array verwendeten hMSC-OP (Ø 86,75±6,78 Jahre), sowie hMSC aus 9 weiteren Spendern mittleren Alters (Ø 47±5,32 Jahre, hMSC-K) als Kontrolle durchgeführt. Nach densitometrischer Auswertung der einzelnen PCR-Ergebnisse und Normalisierung auf das Haushaltsgen EEF1A1 (eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1) wurden von jedem Gen die relativen Expressionsstärken gemittelt (Ø) in den hMSC-OP (ØhMSC-OP) und hMSC-K (ØhMSC-K) Populationen. Die Standardabweichung (STABW) wurde in Prozent zu ØhMSC-OP bzw. ØhMSC-K gesetzt, der FC aus den Mittelwerten berechnet (FC= ØhMSC-OP/ØhMSC-K) und mit dem FC der MikroarrayAnalyse (FC[hMSC-OP/hMSC-K]) verglichen und bewertet: + FC(ØhMSC-OP/ØhMSC-K) > 1,5 bzw. < 0,667 entsprechend Mikroarray-Ergebnissen (+) FC(ØhMSC-OP/ØhMSC-K): 1,5-1,2 bzw. 0,667-0,8 entsprechend Mikroarray-Ergebnissen — keine Übereinstimmung RGS4

Ergebnisse

Vergleich der Genexpression von hMSC-K mit hMSC-OP

Genexpression in Prozent [%]

500 400 300

Ø hMSC-K Ø hMSC-OP

200 100 0

Abb. 19 Graphische Darstellung der Ergebnisse aus Tab. 11 zur biologischen Evaluierung der Mikroarray-Ergebnisse zu osteoporotischen hMSC mittels semi-quantitativer PCR und Densitometrie. Angegeben sind die Mittelwerte der densitometrischen Berechnung zur relativen Genexpressionsstärke der einzelnen Gene in hMSC-OP (ØhMSC-OP) und hMSCK (ØhMSC-K) nach Normalisierung auf das Haushaltsgen EEF1A1 (eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1). Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.

hMSC573

hMSC572

hMSC547

hMSC535

hMSC353

hMSC296

hMSC295

hMSC247

hMSC276

hMSC558

hMSC-OP

hMSC-K

Abb. 20 Heatmap der Mikroarray-Hybridisierungssignale von hMSC-K und hMSC-seneszent. Farblich dargestellt sind die Hybridisierungssignale der 5 hMSC-OP-, sowie der 5 hMSC-K-Populationen für alle Probesets der für die semiquantitative PCR ausgewählten Gene. Je Probeset wurde ein Mittelwert gebildet (schwarz); der hellste Rotton markiert ein 4fach höheres Hybridisierungssignal im Vergleich zum Mittelwert, der hellste Grünton ein 4fach geringeres Signal.

Ergebnisse

5.1.5

Vergleich in-vivo-Alterung, Seneszenz und Osteoporose

Die drei verschiedenen SAM-Datensätze zu Seneszenz (siehe 5.1.3), in-vivo-Alterung (siehe 5.1.2) und Osteoporose (siehe 5.1.4) in hMSC wurden miteinander verglichen, um Gemeinsamkeiten zu detektieren. Da in den SAM-Berechnungen sowohl hMSC-alt, hMSC-seneszent als auch hMSC-OP immer mit den identischen hMSC-K verglichen wurden, sollten mögliche Überlappungen der Daten zuverlässige Angaben darstellen. Alle Genprodukte/Probesets mit 1,5facher Expressionsänderung wurden miteinander verglichen und als Venn-Diagramm für die erhöhte bzw. reduzierte Genexpression dargestellt (Abb. 21). Es zeigte sich, dass 42 Genprodukte (davon 6 unbekannt, siehe Anhang) in allen drei Datensätzen geringer und 7 Genprodukte (davon 3 unbekannt) höher exprimiert werden.

Abb. 21 Venn-Diagramme des Vergleichs der differentiell exprimierten Genprodukte der SAM-Analysen zu hMSC-alt, hMSC-seneszent und hMSC-OP. A: Vergleich der erhöhten Genexpression (FC > 1,5, q < 10%) aller drei SAM-Analysen, B: Vergleich der verringerten Genexpression (FC < 0,667, q < 10%) aller drei SAM-Analysen. Angegeben ist die jeweilige

Ergebnisse Anzahl an Genprodukten/Probesets (GP) pro SAM. Die überlappenden Bereiche enthalten die Anzahl an gemeinsamen Genprodukten, eine Auswahl an betroffenen Genen ist angegeben. Bei dieser Analyse wurden Probesets und nicht Gene miteinander verglichen, wodurch in einigen Fällen verschiedene Probesets für ein-und dasselbe Gen in verschiedenen Überlappungen auftraten (IGFBP5, IGF2BP2, TOP2A) und es dadurch zu Doppelnennungen kam. Alle überlappenden Genprodukte/Probesets sind im Anhang nochmals ausführlich aufgelistet (Tab. 20).

Für die 42 geringer exprimierten Genprodukte konnten mittels GOstat-Analyse überrepräsentative GO-Gruppen gefunden werden (Tab. 12, erste Spalte), u.a. spielen diese Gene, die in hMSC-alt, hMSC-seneszent und hMSC-OP geringer exprimiert werden, eine Rolle beim Ablauf der Mitose, des Spindelapparats, der Mikrotubuliaktivität und der DNA-Reparatur. Der aufgrund von Seneszenz, Alter oder Osteoporose reduzierten Genexpression konnten auch Gene der ATPase-Aktivität und ATPBindung zugeordnet werden. Alle überrepräsentierten GO-Gruppen sind im Anhang nochmals ausführlich aufgelistet.

5.1.5.1

Vergleich in-vivo-Alterung und Seneszenz

Ein Vergleich der SAM-Ergebnisse zur in-vivo-Alterung (Spender von hMSC-alt: Ø 81,75±4,86 Jahre) mit den Ergebnissen zur in-vitro-Alterung (Spender von hMSC-seneszent: Ø 56,4±8,96 Jahre) wurde angestellt, um zu überprüfen, ob sich hMSC während der Alterung des Organismus auf dem Weg zur Seneszenz befinden. Es zeigte sich, dass insgesamt 396 Genprodukte in seneszenten als auch in in-vivo-gealterten hMSC geringer und nur 79 Genprodukte in beiden höher exprimiert werden (Abb. 21, siehe oben). Es wurden GOstat-Analysen von diesen Genprodukten, abzüglich jener 42 bzw. 7 Probesets, die in allen 3 Mikroarray-Datensätzen differentiell exprimiert werden (siehe oben), durchgeführt. Es zeigte sich, dass durch in-vivo- und in-vitro-Alterung geringer exprimierte Genprodukte überrepräsentativ häufig am Ablauf des Zellzyklus und der Zellteilung beteiligt sind (Tab. 12). Aber auch Genprodukte der Immunantwort und des Mikrotubuli-Cytoskeletts sind betroffen. Des Weiteren wurde das Transkriptom von hMSC-alt und hMSC-seneszent unabhängig von statistischen Analysen auf Veränderungen hin untersucht, die auf mögliche Störungen in der Knochen-bildenden Funktion schließen lassen. Zu diesem Zweck wurden die Datensätze der beiden SAM nach differentiell exprimierten Genen durchsucht, die eine Rolle beim Knochenumbau, der Signalgebung durch Wachstumsfaktoren, der Migration, dem Zellzyklus, der Seneszenz oder im Immunsystem spielen (Tab. 13). Seneszente hMSC als auch hMSC älterer Personen weisen auf RNAEbene z.T. sogar ähnliche Defizite im Knochenumbau auf. Unter anderem sind Gene der hormonellen Signalgebung betroffen (VDR, CYP2R1, ESR1), aber auch Gene von Knochenmarkern wie Kollagene (COL1A1, COL1A2) und TNSALP (APLP) werden geringer exprimiert. Des Weiteren sind viele Knochenrelevante Wachstumsfaktoren differentiell bzw. tendenziell geringer exprimiert, wobei auch hier einige Parallelen zwischen Seneszenz und Alter auftreten. Es konnte ebenso eine erhöhte Genexpression von Inhibitoren des BMP-Signalweges in hMSC-seneszent (GREM2) und hMSC-alt (NOG) detektiert werden, sowie eine reduzierte Expression von LRP5. Auch die Migration ist besonders in seneszenten hMSC negativ beeinflusst durch eine geringere Expression von Hyaluronsäuresynthasen (HAS1, HAS2) und dem Hyaluronsäure-Rezeptor HMMR (hyaluronan-mediated motility receptor). Der Zellzyklus ist in beiden untersuchten hMSC-Gruppen negativ beeinflusst, worauf die verminderte Expression von Cyclinen schließen lässt. Seneszente hMSC weisen jedoch zusätzlich deutlich mehr Seneszenz-Marker auf als in-vivo-gealterte hMSC. Das Immunsystem bzw. Inflammations-assoziierte Gene (z.B. NFKB2, TNFSF4, TLR4) werden gehäuft in hMSC-alt differentiell exprimiert.

Ergebnisse Tab. 12 Überrepräsentierte Gen Ontologie (GO)-Gruppen der differentiellen Genexpression, die sich in 2 bzw. 3 SAMAnalysen überlappen

Ergebnisse Bei der GOstat-Analyse wurden je nach Vergleich unterschiedliche Referenzlisten verwendet. Probesets mit verringerter Expression in hMSC-alt, hMSC-seneszent und hMSC-OP (42) wurden mit den 28112 Probesets verglichen, die in mindestens einer der drei Gruppen überhaupt exprimiert werden. Genprodukte mit verringerter Expression in hMSC-alt und hMSC-seneszent (354) wurden verglichen mit den 27938 Probesets, die in mindesten einer der beiden Gruppen exprimiert werden; überlappende Genprodukte des Vergleichs hMSC-OP versus hMSC-alt (98 für verringerte Genexpression, 89 für erhöhte Genexpression) wurden mit 27581 Probesets verglichen. Bei hMSC-OP versus hMSCseneszent (180) dienten als Referenzliste die 26058 exprimierten Probesets. Gene, die in den oben erwähnten Mikroarray-Evaluierungen mittels semiquantitativer PCR nicht signifikant bestätigt werden konnten, sind grau unterlegt. Bei dieser Analyse wurden Probesets und nicht Gene miteinander verglichen, wodurch in einigen Fällen verschiedene Probesets für ein-und dasselbe Gen in verschiedenen Überlappungen auftraten (IGFBP5, IGF2BP2, TOP2A) und es dadurch zu Doppelnennungen innerhalb der verschiedenen Spalten kam. [%]: gibt den prozentualen Anteil der Anzahl der Gene einer GO-Gruppe im Vergleich zur Gesamtanzahl der Gene dieser Gruppe wieder; p-Wert: Falsch-Positiv-Rate (Benjamini); rot: erhöhte Genexpression; grün: verringerte Genexpression. Alle detktierten GO-Gruppen sind im Anhang nochmals ausführlich aufgelistet (Tab. 27 - Tab. 31).

Tab. 13 Einteilung differentiell exprimierter Gene aus den SAM-Ergebnissen zu hMSC-OP, hMSC-alt und hMSC-seneszent in funktionelle Gruppen

Gen Symbol

Gen Name

Knochenaufbau IBSP integrin-binding sialoprotein TNFRSF11B tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11b SPP1 secreted phosphoprotein 1 EFNB2 ephrin-B2 EPHB4 EPH receptor B4 ALPL alkaline phosphatase, liver/bone/kidney RUNX2 runt-related transcription factor 2 VDR vitamin D receptor CYP2R1 cytochrome P450, family 2, subfamily R, polypeptide 1 ESR1 estrogen receptor 1 AR androgen receptor COL1A1 collagen, type I, alpha 1 COL1A2 collagen, type I, alpha 2 BGLAP bone gamma-carboxyglutamate protein Knochenresorption PTGS2 prostaglandin-endoperoxide synthase 2 CSF1 colony stimulating factor 1 TNFSF11 tumor necrosis factor superfamily, member 11 PTH1R parathyroid hormone 1 receptor CA2 carbonic anhydrase II SPHK1 sphingosine kinase 1 IL6ST interleukin 6 signal transducer (Oncostatin M receptor) BMP-Signalweg GREM2 gremlin 2, cysteine knot superfamily, homolog GREM1 gremlin 1, cysteine knot superfamily, homolog MAB21L2 mab-21-like 2 NOG noggin SMAD3 SMAD family member 3 SMAD1 SMAD family member 1 WNT-Signalweg WISP1 WNT1 inducible signaling pathway protein 1 WISP3 WNT1 inducible signaling pathway protein 3 RACGAP1 Rac GTPase activating protein 1 WNT5B wingless-type MMTV integration site family member 5 b WNT2 wingless-type MMTV integration site family member 2 WNT16 wingless-type MMTV integration site family, member 16 LRP5 low density lipoprotein receptor-related protein 5

hMSC-OP

hMSC-alt

↑

↓

hMSCseneszent

↑ ↓ ↓ ↓ ↓

↓ ↑ ↓ ↓ ↑ ↑

↓ ↑

↑ ↑

↓ ↓ ↓ ↓

↑ ↓ ↓ ↑

↑

↓

↑

↑ ↑ ↓ ↑

↑

↓ ↓ ↓

↓ ↓ ↑

↑

↓ ↓

↓

Ergebnisse CTNNB1 catenin, beta 1 FZD7 frizzled homolog 7 FZD8 frizzled homolog 8 FZD4 frizzled homolog 4 FZD6 frizzled homolog 6 KREMEN1 kringle containing transmembrane protein 1 SOST sclerostin Zellzyklus CCNB2 cyclin B2 CCNA2 cyclin A2 CCNE2 cyclin E2 CCNF cyclin F CCNL2 cyclin L2 CCND1 cyclin D1 CCND2 cyclin D2 CDK2 cyclin-dependent kinase 2 CDC2 cell division cycle 2, G1 to S and G2 to M CDC25A cell division cycle 25 homolog A CDC25B cell division cycle 25 homolog B CDC25C cell division cycle 25 homolog C BTG1 B-cell translocation gene 1, anti-proliferative Seneszenz HELLS helicase, lymphoid-specific PSG1 pregnancy specific beta-1-glycoprotein 1 PSG2 pregnancy specific beta-1-glycoprotein 2 PSG3 pregnancy specific beta-1-glycoprotein 3 PSG4 pregnancy specific beta-1-glycoprotein 4 PSG5 pregnancy specific beta-1-glycoprotein 5 PSG7 pregnancy specific beta-1-glycoprotein 7 CDKN1A cyclin-dependent kinase inhibitor 1A CDKN2A cyclin-dependent kinase inhibitor 2A BMI1 BMI1 polycomb ring finger oncogene MCM3 minichromosome maintenance complex component 3 PTN pleiotrophin SOD2 superoxide dismutase 2, mitochondrial TXNRD1 thioredoxin reductase 1 ARHGAP29 Rho GTPase activating protein 29 Wachstumsfaktoren PDGFA platelet-derived growth factor alpha polypeptide VEGFA vascular endothelial growth factor A VEGFB vascular endothelial growth factor B IGF2BP2 insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2 IGFBP5 insulin-like growth factor binding protein 5 IGF2 insulin-like growth factor 2 IGF2R insulin-like growth factor 2 receptor FGF1 fibroblast growth factor 1 FGFR3 fibroblast growth factor receptor 3 FGFR2 fibroblast growth factor receptor 2 FGFR1 fibroblast growth factor receptor 1 HBEGF heparin-binding EGF-like growth factor EGFR epidermal growth factor receptor FST follistatin TGFB2 transforming growth factor, beta 2 TGFBR1 Transforming growth factor, beta receptor 1 TGFBR2 transforming growth factor, beta receptor II Migration ITGB5 Integrin, beta 5 ITGA4 integrin, alpha 4 PFN1 profilin 1 CYR61 cysteine-rich, angiogenic inducer, 61 MMP14 matrix metallopeptidase 14

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Ergebnisse TIMP2 TIMP metallopeptidase inhibitor 2 TLR4 toll-like receptor 4 TLR3 toll-like receptor 3 HAS1 hyaluronan synthase 1 HAS2 hyaluronan synthase 2 HMMR hyaluronan-mediated motility receptor Epigenetik HDAC8 histone deacetylase 8 HDAC9 histone deacetylase 9 ATRX alpha thalassemia/mental retardation syndrome X-linked DNMT1 DNA methyltransferase 1 Immunsystem/Inflammation OASL 2'-5'-oligoadenylate synthetase-like IL1RAP interleukin 1 receptor accessory protein IL27RA interleukin 27 receptor, alpha IL1RAPL2 interleukin 1 receptor accessory protein-like 2 IL1A interleukin 1, alpha THBS1 Thrombospondin 1 TNFSF4 tumor necrosis factor superfamily, member 4 TNFSF10 tumor necrosis factor superfamily, member 10 IFI35 interferon-induced protein 35 SAA1 / SAA2 serum amyloid A1 / serum amyloid A2 nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in BNFKB2 cells 2

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Die Einteilung in die einzelnen Funktionellen Gruppen erfolgte mittels Literaturangaben. Angegeben sind jene Gene, die in mindestens einem Probeset differentielle Expression aufwiesen. Verringerte Expression: grüner Pfeil, erhöhte Expression: roter Pfeil

5.1.5.2

Vergleich Osteoporose und in-vivo-Alterung

Der Vergleich der differentiellen Genexpression in hMSC-OP mit hMSC-alt dient vor allem der Identifizierung von Unterschieden, da Gemeinsamkeiten auf einen in-vivo-Alterungseffekt schließen lassen. Das Alter der Spender von hMSC-OP und hMSC-K unterscheidet sich im Durchschnitt um 28,6 Jahre. Aus diesem Grund ist nicht auszuschließen, dass Genexpressionsunterschiede aufgrund des Altersunterschieds und nicht der Osteoporose auftreten. Der Altersunterschied zwischen den Patienten von hMSC-OP und hMSC-alt beträgt jedoch durchschnittlich nur 4,45 Jahre. Daher wurden die SAM-Ergebnisse zu hMSC-OP (siehe 5.1.4) und hMSC-alt (siehe 5.1.2) miteinander verglichen, wobei sich zeigte, dass simultan in beiden SAM insgesamt 96 Genprodukte höher und 140 geringer exprimiert werden (Abb. 21). Diese wurden – abzüglich der 7 bzw. 42 oben genannten Genprodukte – einer GOstat-Analyse unterzogen, die nur sehr wenige überrepräsentative GO-Gruppen ermitteln konnte (Tab. 12). Geringer in hMSC-OP und hMSC-alt sind Proteasom-Komponenten exprimiert, eine erhöhte Expression zeigten Gene für Zellproliferation und Neurogenese. Vergessen werden sollte nicht, dass die GOstat-Anaylsen zur überlappenden, differentiellen Genexpression aller 3 beschriebenen SAM (siehe 1. Spalte) auch Ergebnisse des Vergleichs hMSC-OP mit hMSC-alt darstellen, somit auch die Mitose, die Mikrotubuli, der Spindelapparat und Chromosomen betroffen sind. All diese GO-Gruppen sind auch bei den GOstat-Analysen zur SAM hMSC-OP versus hMSC-K aufgetreten (siehe 5.1.4.2, Abb. 18), wodurch die Vermutung entsteht, dass diese allein auf das Alter der hMSC-Spender zurück zu führen sind. Überprüft wurde diese Annahme durch Abzug der Alters-bedingten 96 höher und 140 geringer exprimierten Probesets von den SAM-Ergebnissen zu hMSC-OP. Dadurch ändert sich die Anzahl der in Absatz 5.1.4.1 proklamierten (Abb. 17), differentiell exprimierten Genprodukte in hMSC durch Osteoporose (Abb. 22).

Ergebnisse

Abb. 22 Venn-Diagramm der Mikroarray-Ergebisse zur differentiellen Genexpression in hMSC-OP aus OsteoporosePatienten nach Vergleich mit hMSC-K und Abzug der Alters-bedingten Genexpressionsänderung. Angegeben ist die Anzahl der höher exprimierten Genprodukte (rot), bzw. der geringer exprimierten Genprodukte (grün) in hMSC-OP nach Abzug der 96 bzw. 140 Probesets, die in hMSC-OP als auch hMSC-alt höher, bzw. geringer exprimiert werden.

Erneut wurden GOstat-Analysen durchgeführt mit der bereinigten, differentiellen Genexpression in hMSC-OP (Abb. 23). Es zeigt sich, dass im Vergleich zu 5.1.4.2 (Abb. 18) durch Abzug der Altersassoziierten Genprodukte keine Spindel-, Mitose- oder Mikrotubuli-relevanten GO-Gruppen detektiert wurden. Weiterhin lassen sich allein durch die Osteoporose noch immer Kinetochor- und Replisom-, sowie Replikationsgabel-assoziierte Gene überrepräsentativ in den geringer exprimierten Genen finden. Auch ohne Alters-assoziierter Gene sind in hMSC-OP Genprodukte der Angiogenese und der Zellmotiliät höher exprimiert. Alle überrepräsentierten GO-Gruppen und der enthaltenen Gene sind im Anhang (Tab. 25, Tab. 26) nochmals ausführlich aufgelistet.

Überrepräsentierte GO-Gruppen der differentiellen Genexpression in hMSCOP abzüglich Alters-assoziierter Gene Kinetochor Kondensierte Chromosomen

Zelluläre Komponente

GO-Gruppen

Replisom Nukleäre Replikationsgabel Fokale Adhäsion

Regulation der B-Zell-Aktivität Regulation der Angiogenese

Biologischer Prozess

Regulation der Zellmotilität Positive Regulation der Lokomotion Regulation der MAPKKK-Kaskade

0% verringerte Genexpression erhöhte Genexpression

20%

40%

60%

80%

100%

Anzahl Gene in Prozent

Abb. 23 Überrepräsentierte Gene Ontologie (GO)-Gruppen der differentiell exprimierten Genprodukte in hMSC-OP beim Vergleich mit hMSC-K nach Abzug der Alters-assoziierten Gene, die in hMSC-alt ebenfalls differentiell exprimiert werden. Dargestellt sind die mindestens 1,5fach höher bzw. geringer exprimierten Genprodukten. Als Referenzliste dienten dabei die 25158 Genprodukte, die in hMSC-OP und/oder hMSC-K exprimiert werden. Als 100% ist jeweils die Anzahl an Genen pro Gruppe, die überhaupt in der Referenzliste exprimiert werden, dargestellt. Den jeweiligen Anteil daran, der überrepräsentativ häufig in den differentiell exprimierten Genen auftritt, ist farblich markiert: für erhöhte Genexpression in hMSC-OP: rote Balken, geringere Genexpression in hMSC-OP: grüne Balken.

Die nicht statistische Auflistung von Genen, die spezifischen Knochen- und Vitalitäts-Clustern zugeordnet werden können, verdeutlicht die Unterschiede zwischen der differentiellen Genexpression in hMSC-OP und hMSC-alt (Tab. 13). Es zeigte sich, dass einige, den Knochenaufbau betreffende Gene in hMSC-OP höher exprimiert werden, darunter der Androgenrezeptor (AR) und IBSP, sowie COL1A1. In hMSC-alt werden Knochen-assoziierte Gene geringer exprimiert (RUNX2, 75

Ergebnisse COL1A1, IBSP, EFNB2). In hMSC-OP werden Gene, die in Zusammenhang mit Osteoklastogenese gebracht werden, höher exprimiert (PTGS2, PTH1R, SPHK1, CSF1). Die Seneszenz, der Zellzyklus und der BMP-Signalweg sind im Vergleich zu hMSC-alt nur geringfügig betroffen. Der BMP-Signalweg ist in hMSC-OP ebenfalls nur wenig betroffen. GREM2 und MAB21L2 werden in beiden hMSCPopulationen geringer bzw. höher exprimiert. Des Weiteren ist die Expression von WNT-Inhibitoren – KREMEN1, SOST – erhöht in hMSC-OP. Das Gen des WNT-Rezeptors LRP5 ist ebenfalls in osteoporotischen hMSC höher exprimiert, in hMSC-alt aber geringer exprimiert. Der IGF-Signalweg ist ebenfalls betroffen, die Gene der IGF-Bindeproteine IGFBP5 und IGF2BP2 sind in beiden hMSCPopulationen höher exprimiert, während in hMSC-OP zusätzlich noch IGF2-Expression und in hMSCalt IGF2R-Expression erhöht vorliegt. Der FGF-Signalweg ist in beiden Zellpopulationen unterschiedlich beeinflusst: FGFR2 und FGFR3 sind in hMSC-alt, und FGFR1 ist in hMSC-OP höher exprimiert. In hMSC-alt ist besonders häufig die TGFB-Signalgebung beeinflusst, TGFB2 und zwei TGFB-Rezeptoren sind geringer exprimiert. Differentielle Genexpression von Migrations-relevanten Genen liegt ebenfalls vor, in beiden hMSC-Populationen wird TLR4 geringer exprimiert, des Weiteren ist die Expression von MMP14, TIMP1 und dem Chemoattraktant CYR61 in hMSC-OP erhöht, während TLR3 und HMMR in diesen Zellen geringer exprimiert werden. Vergleich zu hMSC-OP weisen hMSC-alt geringere Expression von Chromosomenkondensation regulierenden Genen HDAC8 und HDAC9 auf. Gene, die für Cycline kodieren, sind ebenfalls in beiden hMSC-Populationen geringer exprimiert, während hMSC-OP zusätzlich den Zellzyklus-Inhibitor P21 (CDKN1A) höher exprimieren und hMSC-alt den P16-Inhibitor BMI1 geringer exprimieren. 5.1.5.3

Vergleich Osteoporose mit Seneszenz

In osteoporotischen hMSC-OP wurde nach Hinweisen auf Seneszenz gesucht durch den Vergleich des Genexpressionsmusters von hMSC-OP mit den SAM-Ergebnissen zu hMSC-seneszent. Es zeigte sich, dass insgesamt 222 Genprodukte in hMSC-OP als auch hMSC-seneszent geringer und 57 Genprodukte in beiden höher exprimiert werden (Abb. 21). Von diesen Genprodukten wurden GOstat-Analysen durchgeführt, abzüglich jener 42 bzw. 7 Probesets, die in allen 3 MikroarrayDatensätzen differentiell exprimiert werden (Tab. 12). Bei den höher exprimierten wurden kaum GOGruppen detektiert, jedoch zeigte sich, dass überrepräsentativ häufig Gene mit Proteinfunktion in Mitose, Chromosomentrennung, DNA-Replikation und DNA-Reparatur geringer in hMSC-seneszent und hMSC-OP exprimiert werden. Des Weiteren sind das Mikrotubuli-Cytoskelett und der Spindelaufbau betroffen. Alle überrepräsentierten GO-Gruppen und die darin enthaltenen Gene sind im Anhang (Tab. 31) nochmals ausführlich aufgelistet. Der nicht-statistische Vergleich von Genen funktioneller Cluster, die differentiell in hMSC-OP und hMSC-alt exprimiert werden, verdeutlicht die Unterschiede zwischen in-vitro-Alterung und Osteoporose in hMSC (Tab. 13). Der Zellzyklus und die Seneszenz sind im Vergleich zu hMSCseneszent in hMSC-OP kaum betroffen. Auffällig scheint jedoch die erhöhte Expression des Seneszenz-assoziierten Zellzyklusregulators P21 (CDKN1A) in hMSC-OP, der in hMSC-seneszent neben CDKN2A (P16) ebenfalls höher exprimiert wird. Seneszente hMSC exprimieren sehr viele PSG-Gene (pregnancy specific beta-1-glycoprotein) und Gene des oxidativen Stress (SOD2, TXNRD1) höher. HELLS, BMI1, Pleiotropin (PTN) und MCM3 (minichromosome maintenance complex component 3) sind geringer exprimiert. Gene, deren Proteine mit dem Knochenumbau assoziiert werden, sind in hMSC-OP kaum differentiell reguliert. Der BMP-Signalweg ist in beiden hMSC-Populationen unterschiedlich betroffen, in hMSC-OP wird GREM2 geringer exprimiert, in hMSC-seneszent GREM1 höher. In beiden hMSC-seneszent sind FZD-Gene (frizzled homolog) höher exprimiert, und in hMSC-OP sind Gene für WNT-Hemmer höher exprimiert (KREMEN1, SOST). LRP5 wird in hMSC-OP höher und in hMSC-seneszent geringer exprimiert. Während in hMSC-seneszent viele Wachstumsfaktoren geringer exprimiert werden (IGF2, FGF1, HBEGF, PDGFA, VEGFA), sind einige in hMSC-OP höher exprimiert (IGF2, HBEGFA, PDGFA, VEGFB). In beiden hMSC-Populationen wird HMMR geringer exprimiert und in hMSC-seneszent werden zusätzlich die Gene der Hyaluronsynthasen HAS1 und HAS2 reprimiert exprimiert. 76

Ergebnisse Die Knochenresorption fördernde Proteine zeigen in hMSC-seneszent eine erniedrigte Genexpression, wie z.B. RANKL (TNFSF11) und Prostaglandin-endoperoxid-Synthase 2 (PTGS2). Knochenaufbauassoziierte Gene sind in hMSC-seneszent geringer exprimiert (SPP1, ALPL, COL1A2, ESR1, EFNB2) und in hMSC-OP höher exprimiert (IBSP, AR, COL1A1).

5.2 Kandidatengene der Seneszenz 5.2.1

Nachweis der Seneszenz in hMSC

Ob hMSC nach in-vitro-Alterung tatsächlich in die Seneszenz eingetreten waren, wurde mit verschiedenen Seneszenz-Markern auf RNA- und Proteinebene überprüft. Die Wachstumskurve der Langzeitkultivierung von hMSC bis zum Proliferationsstopp zeigt individuelle Unterschiede in der Wachstumskinetik der verschiedenen hMSC-Populationen, aber eine deutliche Abnahme der Wachstumsgeschwindigkeit in den letzen Tagen der Kultivierung war in allen Fällen gegeben (Abb. 24). Insgesamt wurden die Zellen von P1 bis zur vorletzten Passage (Px-1) 103 bis 162 Tage lang kultiviert. Die kumulativen Populationsverdopplungen (PD) variierten in dieser Zeit zwischen ca. 11 und 24. Aufgrund der Kultivierungsmethode können keine Angaben zum PD vom Zeitpunkt der Zellaussaat bis zu P1 gemacht werden.

Abb. 24 Wachstumskurve von hMSC in Kultur. Vor jeder Subkultivierung wurde die Zellzahl von P1 bis zur vorletzten Passage (Px-1) ermittelt und die Populationsverdopplung berechnet. Angegeben sind die kumulativen Populationsverdopplungen von hMSC aus 7 verschiedenen Spendern im Verlauf der Kultivierungszeit. Geschlecht und Alter der Spender sind angegeben.

Die Mikroarray-Analysen ergaben eine 2,88 – 4,79fach erhöhte Genexpression des Seneszenzmarkers P16 (CDKN2A) in hMSC-seneszent verglichen mit hMSC-K. Die Evaluierung mittels semi-quantitativer PCR zeigte, dass die Expression des Gens ausschließlich in der seneszenten Passage Px induziert wird und somit exklusiv ist, da in allen untersuchten 5 hMSC-Populationen keine Expression in P1 detektierbar war (Tab. 10).

Ergebnisse Auch auf Proteinebene konnte P16 mittels Immuncytochemischer Färbung im Cytoplasma von hMSCseneszent nachgewiesen werden, während P1 der hMSC-Population negativ für P16 war (Abb. 25A). Western-Blot Analysen von 4 verschiedenen hMSC-Populationen zeigten ähnliche P16-Konzentrationen in P1 und Px (Abb. 25B). Der Abgleich auf das Haushalts-Protein GAPDH mittels densitometrischer Auswertung veranschaulichte jedoch die erhöhte P16-Proteinexpression in den seneszenten Passagen von 3 hMSC-Populationen (Abb. 25C).

hMSC574 P1

hMSC543 P1

hMSC545 P1

hMSC661 P1

P16 GAPDH

50 µm

1000

P16 relative Proteinexpression in [%]

800 600 400 200 0 P1

IgG

50 µm

2. AK

50 µm

hMSC574

hMSC543

hMSC545

hMSC661

Abb. 25 Nachweis des Seneszenz-Marker P16 in in-vitro-gealterten hMSC. A: Immuncytochemischer Nachweis von P16 in seneszenten hMSC. Der Nachweis erfolgte mit spezifischem anti-P16 Primärantikörper in hMSC P1 (a) und hMSC in der seneszenten Passage Px (b). Die Inkubationen mit Rabbit IgG (c) und Sekundärantikörper allein (d) in P1 dienten als Kontrollen für die Spezifität des anti-P16 Antikörpers. B: Western-Blot von Gesamtprotein von 4 verschiedenen hMSCPopulationen in P1 und der seneszenten Passage Px. Als Primärantikörper wurden anti-P16 und anti-GAPDH (Glycerinaldehyde 3-phosphate dehydrogenase) für den Nachweis des Haushaltsproteins verwendet. C: Densitometrische Auswertung der Western-Blots, alle Werte wurden auf GAPDH normiert und in Prozent zu hMSC574 P1 gesetzt.

In 5 weiteren hMSC-Populationen wurde die CDKN2A-Expression im Verlauf der in-vitro-Alterung auf RNA-Ebene untersucht. Semi-quantitative PCR an allen Passagen der hMSC wurden mit spezifischen Primern durchgeführt. Es zeigte sich, dass CDKN2A in P1 aller 5 hMSC-Populationen nicht exprimiert wird, in Px hingegen schwach bis sehr stark. In hMSC von 2 Spendern nimmt die Expression mit Anzahl der Passagen graduell zu (Bsp.: Abb. 26A). In hMSC von 3 Spendern konnten jedoch auch schwache bis starke Expression des Gens in einigen mittleren Passagen gezeigt werden (Bsp.: Abb. 27A). Als weiterer, möglicher Seneszenzmarker wurde PSG5 als repräsentatives Gen der pregnancy specific beta-1-glycoprotein Familie in diesen hMSC-Populationen in jeder Passage auf RNA-Ebene untersucht. In 4 der 5 hMSC-Populationen stiegt die PSG5-Expression von sehr gering in P1 bis zu sehr hoch in Px an, wobei jedoch bereits in frühen Passagen (ab P2 - P5) eine erhöhte Expression zu detektieren war (Abb. 26A, Abb. 27A). Alle Densitometrie-Ergebnisse zu PSG5- und CDKN2A-Expression im Verlauf der in-vitro-Alterung sind zu finden unter 5.2.4. Als weiterer Nachweis der Seneszenz wurden SA-β-Gal-Färbungen von 10 hMSC-Populationen in P1 und Px bei pH 5 durchgeführt. In allen Fällen wiesen die Zellen in Px unabhängig vom Geschlecht und dem Alter der Patienten (Ø = 65,7±11) eine starke bis leicht erhöhte β-Gal-Aktivität, sowie extreme morphologische Veränderungen auf (Bsp.: Abb. 26C P1 und P11, Abb. 27C P1 und P14). Verglichen mit hMSC in P1 waren die seneszenten Zellen durch eine größere, breitere Form, sowie dendriteartige Ausläufer und Zelltrümmer gekennzeichnet. Jedoch waren bei hMSC von 2 Spendern bereits in P1 viele für SA-β-Gal positive Zellen zu finden (Abb. 26C P1). Von hMSC aus 5 Spendern wurden SA-β-Gal-Färbungen in jeder Passage durchgeführt um die Aktivität des Enzyms im Verlauf der in-vitro-Alterung zu dokumentieren. Es zeigte sich, dass nicht 78

Ergebnisse allein in der letzten Passage, sondern auch in mittleren Passagen eine deutliche SA-β-Gal-Aktivität detektiert werden konnte. Auffällig dabei war, dass die blau gefärbten Zellen meist eine breitere Morphologie aufwiesen als die nicht gefärbten Zellen der betroffenen Passage. Ein Vergleich dieser positiven Passagen mit dem CDKN2A- oder PSG5-Expressionsmuster auf RNA-Ebene im Verlauf der in-vitro-Alterung lieferte kaum Übereinstimmungen (Abb. 26C, Abb. 27C).

Abb. 26 Analyse der einzelnen Passagen von hMSC614 im Verlauf der in-vitro-Alterung mit Hilfe von Seneszenz-Markern. Passage (P) 11 ist die letzte und damit seneszente Passage, da die Zellen innerhalb von 3 Wochen keine Konfluenz erreicht hatten. Von Passage 3 konnten keine Analysen durchgeführt werden. A: Semi-quantitative PCR von CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), PSG5 (pregnancy specific beta-1-glycoprotein 5) und dem Haushaltsgen EEF1A1 (eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1); B: Photometrische Bestimmung der SA-β-Gal-Aktivität in jeder Passage bei 70-90%iger Konfluenz. Die Absorption bei 405 nm wurde in Prozent angegeben. C: SA-β-Gal-Färbung von jeder Passage bei ca. 50%iger Konfluenz, das Cytoplasma der positiven Zellen ist blau gefärbt. Gegenfärbung: Kernechtrot. Maßstabsbalken: 100 µm.

Um die SA-β-Gal-Aktivität effektiver quantifizieren zu können, wurde ein zweiter Assay angewandt, der auf der photometrischen Messung des SA-β-Gal-Substrats beruht. Hierfür wurden die Zellen bis zu 70-90% Konfluenz kultiviert, anschließend lysiert und mit dem Substrat bei pH 6 versehen. Am nächsten Tag erfolgte die Messung bei 405 nm und es zeigte sich bei allen 3 untersuchten hMSCPopulationen (nur zwei gezeigt) ein ähnliches Muster, dass jedoch individuell nicht mit der SA-β-GalFärbung der jeweiligen hMSC-Population übereinstimmte (Abb. 26B, Abb. 27B). Im Falle der hMSC614-Population deutete die Messung auf eine maximale SA-β-Gal-Aktivität in P7 hin, die Färbung bestätigte dies jedoch nicht, obwohl vereinzelt positive Zellen gezeigt werden konnten (Abb. 26B und C). In hMSC625 schien nach photometrischer Messung die Passage P7 die stärkste SA-β-Gal79

Ergebnisse Aktivität auszuweisen, die Färbung hingegen zeigte die höchste Ansammlung SA-β-Gal-positiver Zellen in P5 und P14 (Abb. 27 B und C). Generell war zu beobachten, dass laut SA-β-Gal-AktivitätsMessung kein Unterschied zwischen P1 und Px bestand. Ein Zusammenhang zwischen der Expression des Gens für P16 (CDKN2A) und dem Ergebnis der SA-β-Gal-Aktivitäts-Messung konnte nicht festgestellt werden, wohingegen das Muster der SA-β-Gal-Färbung Parallelen zur CDKN2A-Expression aufweist. Passagen mit hoher Expression von CDKN2A weisen auch mehr SA-β-Gal-positive Zellen auf.

Abb. 27 Analyse der einzelnen Passagen von hMSC625 im Verlauf der in-vitro-Alterung mit Hilfe von Seneszenz-Markern. Passage (P) 14 ist die letzte und damit seneszente Passage, da die Zellen innerhalb von 3 Wochen keine Konfluenz erreicht hatten. A: Semi-quantitative PCR von CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), PSG5 (pregnancy specific beta-1-glycoprotein 5) und dem Haushaltsgen EEF1A1 (eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1); B: Photometrische Bestimmung der SA-β-Gal-Aktivität in jeder Passage bei 70-90%iger Konfluenz. Die Absorption bei 405 nm wurde in Prozent angegeben. C: SA-β-Gal-Färbung von jeder Passage bei 50%iger Konfluenz, das Cytoplasma der positiven Zellen ist blau gefärbt. Gegenfärbung: Kernechtrot. Maßstabsbalken: 100 µm.

Ergebnisse

5.2.2

Kandidatengensuche

Die Mikroarray-Ergebnisse des Vergleichs hMSC-seneszent mit hMSC-K dienten als Grundlage für die Identifizierung von Genen, die für den Eintritt in den Zustand der Seneszenz von hMSC relevant sein könnten. Um die Daten der SAM besser deuten und Kandidatengene heraus filtern zu können, wurde ein Punktesystem entwickelt um den einzelnen, differentiell exprimierten Genen eine Wertigkeit zuzuordnen. Zum einen wurde die Verlässlichkeit der Mikroarray-Ergebnisse geprüft, indem die Anzahl an Genprodukten pro Gen, die differentiell exprimiert werden, sowie die Höhe des FC bewertet wurden. Zum anderen diente eine Literaturrecherche dazu, Gene zu detektieren, deren Bedeutung für Alterung oder Knochen bereits beschrieben ist. Für die Punktevergabe wurden zu Beginn all jene Genprodukte herausgestrichen, die keine beschriebenen Gene bzw. nur hypothetische Gene repräsentierten. Des Weiteren wurde die Stringenz für die differentielle Genexpression erhöht, um möglichst eindeutige Genexpressionsmuster aufdecken zu können. Nur jene Genprodukte, die einen q-value < 10%, sowie einen FC < 0,5 bzw. > 2 aufwiesen, galten für die Erstellung der Kandidatenliste als signifikant (mindestens 2fach) geringer bzw. höher exprimiert in hMSC-seneszent. Im Falle von mehreren Genprodukten bzw. Probesets pro Gen wurden Punkte vergeben, je nachdem wie viele Probesets laut SAM differentiell exprimiert waren. 10 Punkte wurden vergeben, wenn 100% der Probesets eines Gens differentiell in dieselbe Richtung exprimiert waren; 7 Punkte für > 50% der Probesets, 1 Punkt für 50% und zusätzlich 3 Punkte, wenn ein Gen durch mindestens 3 positive Probesets repräsentiert wurde. Gene mit weniger als 50% differentiell exprimierten Probesets wurden aus der Liste getilgt. Die Genexpressionsänderung („fold change“, FC) wurde ebenfalls mit Punkten versehen: je höher bzw. geringer der FC, desto höher die Punktzahl (Tab. 14). Tab. 14 Punktevergabe für Höhe des Foldchange (FC) in SAM von hMSC-seneszent versus hMSC-K

Punkte

FC (hMSC-OP/ hMSC-K

FC ab < 0,5 > 0,3333

FC ab > 2 0,2

0,1

< 10

> 0,05

< 20

< 0,05

> 20

Auch exklusive Expression in einer der beiden Vergleichgruppen wurde bewertet. Exklusive Expression in hMSC-seneszent bedeutete, dass das betreffende Genprodukt mindestens in 4 der 5 hMSC-seneszent RNA-Proben, die mit Microchips hybridisiert wurden, eine Expression aufwies („present“), während in mindestens 4 von 5 hMSC-K keine Expression detektiert wurde („absent“). Jene Probesets, auf die diese Bedingungen zutrafen, erhielten zusätzlich 5 Punkte. Ebenso jene Probesets, deren Expression ausschließlich in hMSC-K induziert wurde. Die Summe all dieser Punkte zusammen, diente als erstes Auswahlkriterium. 100 Gene mit der höchsten Summe für erhöhte Expression und 100 Gene mit der höchsten Summe für erniedrigte Expression wurden einer Literaturrecherche unterzogen hinsichtlich ihrer bisher bekannten Bedeutung für Knochenmetabolismus, Alterung und Osteoporose. Die Literaturrecherche wurde mit PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) durchgeführt und folgende Stichworte wurden in die Suchmaske eingegeben: für Knochenmetabolismus: „bone, osteoblast“; für Alterung: „aging, senescence“ und für Osteoporose: „osteoporosis“. 10 Punkte wurden für Gene vergeben, bei denen 81

Ergebnisse mit Hilfe dieser Suchworte eine direkte Verbindung zu dem jeweiligen Kriterium hergestellt werden konnte, bzw. wenn das betreffende Gen in dieser Hinsicht bereits als differentiell exprimiert beschrieben wurde. 5 Punkte wurden vergeben, wenn die gesuchten Gene peripher mit dem jeweiligen Kriterium assoziiert werden konnten, 0 Punkte wenn keinerlei Verbindung hergestellt werden konnte. Anhand der totalen Summe aus Literaturrecherche, FC-Punkten, Probeset-Punkten und Punkten für induzierte Expression ergab sich die Reihenfolge der Wertigkeit der differentiell exprimierten Gene. In Tab. 15 sind auszugsweise nur die am höchsten bewerteten 50 Gene zu finden, die vollständige Liste ist im Anhang aufgeführt (Anhang Tab. 33). Im Falle von mehreren Genprodukten bzw. Probesets pro Gen wurde nur jenes Probeset mit der stärksten differentiellen Genexpression (FC) ausgewählt, um das Gen in dieser Kandidatenliste zu repräsentieren.

Tab. 15 Rangliste der besten 50 Kandidatengene für die Seneszenz in hMSC

Gen Symbol

Gen Name

hMSCseneszent/ hMSC-K FC

SAA1/SAA2 serum amyloid A1 /serum amyloid A2 nuclear receptor subfamily 3, group NR3C2 C, member 2 insulin-like growth factor binding IGFBP5 protein 5 EDN1 endothelin 1 tumor necrosis factor receptor TNFRSF11 superfamily, member 11a, NFKB A activator CD36 CD36 molecule protein tyrosine phosphatase, PTPRZ1 receptor-type, Z polypeptide 1 OXTR oxytocin receptor

ProbesetPunkte

exklusive Exp.

FCPunkte

Literatur-Punkte Alter ung

q (%)

52,18

0,89

14,33

0,00

8,69

1,02

6,48

total

Knoch Osteo en porose

1,61

3,77

4,16

7,14

7,00

5,78

1,02

5,21

1,61

6,30

0,31

HDAC9

histone deacetylase 9

COL4A4

collagen, type IV, alpha 4

34,70

0,00

COL4A3

25,29

0,00

12,60

3,36

5,67

0,43

13,73

4,84

4,91

2,43

4,71

0,19

10,76

3,36

9,08

0,31

8,99

0,89

8,47

0,50

7,72

9,54

7,00

0,43

6,83

3,36

6,38

0,58

EPHA5

collagen, type IV, alpha 3 pregnancy specific beta-1glycoprotein 7 cadherin 1, type 1, E-cadherin pregnancy specific beta-1glycoprotein 1 calcium channel, voltage-dependent, beta 4 subunit protein kinase, cGMP-dependent, type II cyclin D2 pregnancy specific beta-1glycoprotein 6 serpin peptidase inhibitor, B, member 2 cytochrome P450, family 26, subfamily B, polypeptide 1 pregnancy specific beta-1glycoprotein 4 wingless-type MMTV integration site family member 2 solute carrier family 39, member 8 pregnancy specific beta-1glycoprotein 9 EPH receptor A5

6,31

1,43

HELLS

helicase, lymphoid-specific

0,19

0,50

CA2

carbonic anhydrase II hyaluronan-mediated motility receptor

0,02

1,61

0,03

0,00

PSG7 CDH1 PSG1 CACNB4 PRKG2 CCND2 PSG6 SERPINB2 CYP26B1 PSG4 WNT2 SLC39A8 PSG9

HMMR

Ergebnisse FOXM1

forkhead box M1

0,05

0,00

HAS1

hyaluronan synthase 1

0,05

1,25

HGF

hepatocyte growth factor

0,07

0,00

CDC20

cell division cycle 20 homolog

0,05

0,00

LMNB1

lamin B1

0,13

DEPDC1

DEP domain containing 1

BIRC5

0,00

0,03

0,00

0,05

0,00

0,09

0,00

PTN

baculoviral IAP repeat-containing 5 SRY (sex determining region Y)-box 11 pleiotrophin

0,11

0,00

SOX4

SRY (sex determining region Y)-box 4

0,17

0,00

SCRG1

stimulator of chondrogenesis 1 budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog cell division cycle associated 8

0,05

0,21

0,05

0,00

0,06

0,00

0,07

1,02

0,09

0,00

0,09

0,00

0,05

0,00

0,09

0,00

EXO1

stearoyl-CoA desaturase transforming, acidic coiled-coil containing protein 3 budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog beta cell division cycle 2, G1 to S and G2 to M antigen identified by monoclonal ab Ki-67 exonuclease 1

0,05

0,00

FGFR2

fibroblast growth factor receptor 2

0,09

0,00

AURKB

aurora kinase B

0,11

0,00

TK1

thymidine kinase 1, soluble

0,12

0,00

SOX11

BUB1 CDCA8 SCD TACC3 BUB1B CDC2 MKI67

Es wurde ein Wertigkeitssystem entwickelt, um mögliche Kandidatengene der Seneszenz aus den MikroarrayErgebnissen von hMSC-seneszent versus hMSC-K zu ermitteln. Für alle Gene, deren Probesets einen q-Wert < 10% und eine Gen-expressionsänderung (FC) > 2 bzw. < 0,5 aufwiesen, wurden Punkte vergeben für die Anzahl an differentiell exprimierten Probesets, die eventuell vorhandene, exklusive Expression und die Höhe des FC. Eine Literaturrecherche hinsichtlich der Funktion der Gene in Knochenmetabolismus, Alterung/Seneszenz und Osteoporose wurde ebenfalls bewertet. Die totale Summe aus diesen Punkten diente als Richtwert der betreffenden Gene für deren mögliche Bedeutung in der Seneszenz von hMSC. Pro Gen ist jeweils nur jenes Probeset mit der höchsten differentiellen Genexpressionsänderung angegeben. Gene, die in semi-quantitativen PCR-Ansätzen (Tab. 10) nicht nachgewiesen werden konnten (z.B. SFRP4), wurden aus der Liste heraus genommen. Rote Markierung: mindestens zweifach erhöhte Genexpression in Px im Vergleich zu P1 (FC ≥ 2); grüne Markierung: mindestens zweifach erniedrigte Genexpression in Px im Vergleich zu P1 (FC ≤ 0,5).

5.2.3

A-SAA – Auswirkung auf die Funktion von hMSC 5.2.3.1

Einfluss von A-SAA auf die Seneszenz

Wie in der Kandidatenliste ersichtlich, ist die Expression der Akute-Phase Serum Amyloide A (A-SAA) mRNA SAA1 und SAA2 bis zu 52-fach erhöht in seneszenten hMSC (Tab. 15). Dies ist die stärkste Genexpressionsänderung, die in den Mikroarray-Analysen zur Seneszenz von in-vitro-gealterten hMSC detektiert werden konnte. Semi-quantitative PCR Analysen zur Genexpression von SAA1 und SAA2 wurden an hMSC P1 und Px (letzte, seneszente Passage) von 12 verschiedenen Spendern durchgeführt, um das Ergebnis der SAM zu evaluieren. Die Ergebnisse wurden densitometrisch quantifiziert, wobei jedoch bei 4 Spendern keinerlei Expression der beiden Gene in P1 detektiert werden konnte, somit eine densitometrische Auswertung nicht möglich war. In Tab. 16 sind daher die Densitometrie-Ergebnisse tabellarisch dargestellt. In 8 hMSC-Populationen war mindestens eine 1,5fach erhöhte Expression von SAA1 in der seneszenten Passage Px im Vergleich zu P1 zu beobachten. In ebenfalls 8 Spendern, die sich z.Z. von den SAA1 höher exprimierenden Zellen unterscheiden, wurde eine erhöhte Expression von SAA2 83

Ergebnisse in Px im Vergleich zu P1 detektiert. In nur 2 hMSC-Populationen zeigte sich das Expressionsmuster von SAA1 und SAA2 genau gegensätzlich (hMSC 622 und hMSC 540). Beide Gene wiesen nur in drei Fällen eine geringere Expression in Px im Vergleich zu P1 auf. SAA1 konnte in 2 hMSC-Populationen, SAA2 in 4 hMSC-Populationen mehr als 10fach höher exprimiert bzw. exklusiv in Px exprimiert vorgefunden werden. Tab. 16 Ergebnisse der densitometrischen Auswertung von semi-quantitativen PCR-Analysen zur Expression von SAA1 und SAA2 in hMSC in Px nach in-vitro-Alterung im Vergleich zu P1.

Genexpressionsänderung hMSCPopulation 574 613 614 622 625 539 542 545 540 271 274 276

SAA1 (Px/P1) — — —— ++ + ++ — +++ + ++ + +++

SAA2 (Px/P1) + + — —— + + — +++ —— +++ +++ +++

Die densitometrisch ermittelten Wert wurden auf das Haushaltsgen EEF1A1 (eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1) normalisiert und die Genexpressionsänderung (Px/P1) bestimmt. Bei fehlender Expression in P1 konnte keine quantitative Auswertung durchgeführt werden, die Expression von SAA1 (serum amyloid A1) bzw. SAA2 (serum amyloid A2) wurde in diesem Fall als exklusiv in Px definiert. Eine Genexpressionsänderung zwischen 0,667 und 1,5 bedeute, dass kein Unterschied in der Höhe der Expression zwischen Px und P1 vorliegt. Eine Änderung von 0,667 bedeutet eine 1,5fach geringere Expression im Vergleich zu P1. Genexpressionsänderung in Px im Vergleich zu P1: -< 0,667fach keine Genexpressionsänderung + > 1,5fach ++ > 5fach +++ > 10fach oder exklusiv

5.2.3.2

Stimulation mit rhSAA1 während osteogener Differenzierung

Um die Bedeutung von A-SAA auf den Stammzellcharakter von hMSC zu untersuchen, wurden Zellen von 3 verschiedenen Spendern mit 1mM rekombinantem SAA1 (rhSAA1) osteogen differenziert. Es zeigte sich, dass die mit rhSAA1 stimulierten hMSC deutlich mehr Kalziumhydrogenphosphat in ihre extrazelluläre Matrix eingelagert hatten als nicht stimulierte Zellen (Abb. 28A-C). Kein Einfluss von A-SAA wurde in den Differenzierungskontrollen mit Expansionsmedium detektiert. Auf mRNAEbene wurde die Expression von SAA1 und SAA2 generell in allen osteogenen Differenzierungen verstärkt (Abb. 28E). Ein geringer Unterschied in der A-SAA-Expression nach osteogener Differenzierung mit und ohne rhSAA1-Supplementation konnte nur an hMSC eines Spenders gezeigt werden (hMSC644). Diese Zellen zeigen zudem den geringsten Unterschied in der Mineralisierung zwischen behandelten und unbehandelten Differenzierungen, sowie eine erhöhte SSP1- und BGLAPExpression nach osteogener Differenzierung mit rhSAA1 auf. Es konnte kein einheitliches Expressionsmuster der beiden osteogenen Differenzierungsmarker in den verschiedenen hMSC84

Ergebnisse Populationen detektiert werden. Kontrollzellen, die 3 Wochen mit rhSAA1 behandelt wurden, zeigen bei hMSC622 und hMSC644 eine erhöhte SAA1- und SAA2-Expression. + rhSAA1 (1mM) Kontrolle

Osteogen differenziert

Kontrolle

Osteogen differenziert

hMSC625 100 µm

100 µm

hMSC622 100 µm

100 µm

hMSC644 100 µm

100 µm

hMSC-TERT 100 µm

hMSC625

E K

+rhSAA1 o.D. K o.D. K

100 µm

hMSC622 +rhSAA1 o.D. K o.D.

100 µm

hMSC644 K

+rhSAA1 o.D. K o.D.

100 µm

hMSC-TERT

EEF1A1

SAA1

SAA2

SPP1

BGLAP

+rhSAA1 o.D. K o.D.

Abb. 28 Osteogene Differenzierung von hMSC und hMSC-TERT mit rekombinantem, humanem SAA1 (rhSAA1). Humane MSC aus 3 verschiedenen Spendern wurden 3 Wochen in osteogenem Differenzierungsmedium bzw. hMSCExpansionsmedium (Kontrolle) mit und ohne 1mM rhSAA1 kultiviert. Anschließend wurde die Kalziumhydrogenphosphat-Einlagerung in die extrazelluläre Matrix mit Alizarin Rot S nachgewiesen (A-C) und die Genexpression von EEF1A1 (eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1), SAA1 (serum amyloid A1), SAA2 (serum amyloid A2), SPP1 (secreted phosphoprotein 1, Osteopontin) und BGLAP (bone gamma-carboxyglutamate protein, Osteocalcin) mittels semi-quantitativer PCR untersucht (E). Telomerase-immortalisierte hMSC-TERT wurden 10 Tage unter 1mM rhSAA1-Stimulation osteogen differenziert und der Differenzierungsgrad bzw. das Genexpressionsmuster ebenfalls mittels Alizarin Rot S (D) bzw. semi-quantitativer PCR untersucht (F). K = Kontrolle, o.D. = osteogen differenziert

Verstärkte Matrixbildung durch rhSAA1-Stimulation konnte ebenfalls in 10 Tage osteogen differenzierten hMSC-TERT gezeigt werden, wenn auch deutlich schwächer als in hMSC (Abb. 28D). Eine Differenzierung über einen längeren Zeitraum hinweg war nicht möglich, da die Kontrollzellen im Expansionsmedium nach mehr als 10 Tagen den Kontakt zum Untergrund verloren und sich als Zellrasen ablösten. Auf mRNA-Ebene wurde auch in den immortalisierten hMSC-TERT kein signifikanter Unterschied gefunden in der A-SAA-Expression zwischen Zellen mit und ohne rhSAA1-

Ergebnisse Stimulation (Abb. 28F). Die Differenzierungsmarker SSP1 und BGLAP sind in unbehandelten und behandelten, osteogen differenzierten Zellen ohne signifikante Unterschiede geringer exprimiert. 5.2.3.3

Charakterisierung von stabil mit SAA1 bzw. SAA2 transfizierten hMSC-TERT

Mittels Elektroporation wurden hMSC-TERT mit SAA1-pcDNA3.1(+) bzw. SAA2-pcDNA3.1(+) transfiziert und stabil SAA1- bzw. SAA2-exprimierende, monoklonale Zelllinien hergestellt (SAA1hMSC-TERT bzw. SAA2-hMSC-TERT). Insgesamt wurde das Verfahren drei Mal wiederholt und von diesen verschiedenen Zelllinien jene mit der stärksten A-SAA-Expression auf mRNA-Ebene für die weitere Charakterisierung der Zellen ausgewählt. Als Kontrollzellen dienten bei allen folgenden Experimenten hMSC-TERT und hMSC-TERT, die allein mit dem Vektor pcDNA3.1(+) transfiziert wurden (pcDNA-hMSC-TERT). Mittels semi-quantitativer PCR wurde festgestellt, dass die SAA1-hMSC-TERT-Klone ebenfalls SAA2 exprimieren und die SAA2-hMSC-TERT ebenfalls SAA1, jedoch zusammen mit SAA1 in weitaus höherem Maße (Abb. 29A). Ebenfalls ersichtlich wurde, dass nicht nur die Gesamtexpression von SAA1 bzw. SAA2 in den A-SAA-Klonen erhöht vorliegt, sondern auch die Expression des endogenen ASAA durch das Einbringen von SAA1- bzw. SAA2-Inserts in die Zellen erhöht wurde. Nachgewiesen werden konnte diese Expression (endo) mittels spezifischer Primerpaare, die nicht in der InsertSequenz binden können und somit nur die zelleigene SAA1-bzw. SAA2-mRNA detektieren. Die SAA1-hMSC-TERT bzw. SAA2-hMSC-TERT zeigten des Weiteren eine deutlich erhöhte Proliferationsgeschwindigkeit im Vergleich zu nicht transfizierten hMSC-TERT und den Vektorkontrollen pcDNA-hMSC-TERT (Abb. 29B) Auch die Morphologie der Zellen ist stark verändert. Stabil mit SAA1 als auch mit SAA2 transfizierte Zellen sind deutlich länger und schmaler als hMSC-TERT oder pcDNA-hMSC-TERT. Die SAA2-hMSCTERT Zellen weisen die stärkten morphologischen Veränderungen auf (Abb. 29C). Mit SAA1-hMSC-TERT und SAA2-hMSC-TERT, sowie den Kontrollzellen wurden osteogene Differenzierungsansätze durchgeführt. Aufgrund der erhöhten Proliferationsbereitschaft der stabil transfizierten Zellen, lösten sich die Differenzierungskontrollen (nur Expansionsmedium) bereits nach 6 Tagen ab. Aus diesem Grund wurden die Zellen nur 5 Tage osteogen stimuliert. Trotz der kurzen Zeit konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von SAA1 bzw. SAA2 in hMSC-TERT zur verstärkten Mineralisierung führt, wie die Alizarin Rot S-Färbung verdeutlicht (Abb. 30A). Die Kontrollzellen pcDNA-hMSC-TERT zeigen keine Mineralisierung nach 5 Tagen. Auf RNA-Ebene ist die Expression von SAA1 und SAA2 nach der osteogenen Differenzierung in SAA1hMSC-TERT und SAA2-hMSC-TERT am stärksten (Abb. 30C). Der Differenzierungsmarker DMP1 ist durch osteogene Stimulation in allen Zellen, außer pcDNA-hMSC-TERT erhöht, während SPP1 geringer exprimiert wird. Des Weiteren wurde die Auswirkung von Stress auf die Zellen untersucht. Zu diesem Zweck wurde RNA von den stabilen Zelllinien und den Kontrollzellen isoliert nachdem diese 2 Tage in hMSC-TERTExpansionsmedium ohne FCS kultiviert wurden. Als Vergleich dienten Zellen, die nicht unter FCSEntzug in Expansionsmedium kultiviert wurden. Die Auswirkungen wurden mittels SA-β-Gal-Färbung untersucht. Es zeigte sich, dass bereits allein die Überexpression von SAA1 bzw. SAA2 in den stabilen hMSC-TERT zu einer erhöhten Anzahl an SA-β-Gal-positiven Zellen führte (Abb. 30B). Nach 2tägigem Serumentzug wiesen sie zusätzlich eine nochmals veränderte Zellmorphologie auf. Die SAA1-hMSCTERT als auch SAA2-hMSC-TERT erschienen länglicher und schmaler als unter Kultur mit 10% FCS. Humane MSC-TERT und pcDNA-hMSC-TERT dienten als Kontrollen und zeigten kaum SA-β-GalAktivität bzw. nur geringfügig erhöhte Enzymaktivität nach Serumentzug ohne eine Veränderung der Morphologie.

Ergebnisse

hMSC-TERT

EEF1A1 SAA1 SAA1 endo

pcDNA-hMSC-TERT

SAA2 SAA2 endo

SAA1-hMSC-TERT

SAA2-hMSC-TERT

Abb. 29 Auswirkung der Überexpression von SAA1 bzw. SAA2 auf hMSC-TERT. A: semi-quantitative PCR-Analyse von stabilen TERT-Klonen und unbehandelten Zellen mit Primern für EEF1A1 (eukaryotic translation elongation factor 1 alpha a a 1), SAA1 (serum amyloid A1, Primer: SAA1 ) und SAA2 (serum amyloid A2, Primer: SAA2 ). Es wurden ebenfalls Primer verwendet, die nur die endogene Expression von SAA1 (SAA1 endo) bzw. SAA2 (SAA2 endo) detektieren und nicht an das b b klonierte Insert binden können: SAA1 bzw. SAA2 . B: Von stabil transfizierten SAA1-hMSC-TERT und SAA2-hMSC-TERT wurde die kumulative Populationsverdopplung (PD) über einen Zeitraum von 25 Tagen ermittelt und mit pcDNA-hMSCTERT und hMSC-TERT verglichen. C: Dokumentation der morphologischen Veränderungen mittels PhasenkontrastMikroskopie wurden von SAA1-hMSC-TERT bzw. SAA2-hMSC-TERT im Vergleich zu Kontrollzellen durchgeführt.

Auf Genexpressionsebene wurde der Einfluss des FCS-Entzugs ebenfalls untersucht (Abb. 30D). Dabei zeigte sich nicht nur, dass sowohl SAA1 als auch SAA2 in SAA1-hMSC-TERT und SAA2-hMSC-TERT höher exprimiert wurden, sondern dass der FCS-Entzug die Expression der beiden Gene nochmals erhöhte. Das Expressionsmuster der Metalloproteinasen MMP3 und MMP1 wurde ebenfalls untersucht. Beide Gene wurden in den gestressten Zellen höher exprimiert. Die Expression von PSG5 war ebenfalls verändert. Das Gen wurde in SAA1-hMSC-TERT und SAA2-hMSC-TERT nach Serumentzug nicht mehr exprimiert.

Ergebnisse

+FCS

Osteogen differenziert

Kontrolle

- FCS (2d)

hMSC-TERT 200 µm

20µm

200 µm

20µm

pcDNA-hMSC-TERT

200 µm

20µm

200 µm

20µm

SAA1-hMSC-TERT 200 µm

20µm

200 µm

20µm

SAA2-hMSC-TERT

200 µm

hMSCTERT

pcDNAhMSCTERT

20µm

200 µm

SAA1hMSCTERT

SAA2hMSCTERT

hMSCTERT

K o.D. K o.D. K o.D. K o.D.

EEF1A1

SAA1

SAA2

DMP1

MMP1

SPP1

20µm

pcDNAhMSCTERT

SAA1hMSCTERT

SAA2hMSCTERT

FCS

MMP3

PSG5

Abb. 30 Osteogene Differenzierung und Serumentzug von hMSC stabil transfiziert mit SAA1 und SAA2. Osteogene Differenzierung der stabil transfizierten SAA1-hMSC-TERT bzw. SAA2-hMSC-TERT erfolgte über die Kultivierung für 5 Tage in osteogenem Differenzierungsmedium bzw. Expansionsmedium (Kontrolle). Der Nachweis der Mineralisierung erfolgte mittels Alizarin Rot S-Färbung (A). Bereiche, in denen sich der Zellrasen abgelöst hatte, sind mit einem Pfeil markiert. Als Vergleichszellen dienten hMSC-TERT und nur mit Vektor transfizierte pcDNA-hMSC-TERT. B: SA-β-Gal-Färbung mit Kernechtrot als Gegenfärbung von Zellen in hMSC-TERT-Medium (+FCS) und nach 2tägiger Kultur in Serum-freiem Medium (-FCS). C: Semi-quantitative PCR der 5 Tage osteogen differenzierten Zellen mit Primern für EEF1A1 (eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1), SAA1 (serum amyloid A1), SAA2 (serum amyloid A2), DMP1 (dentin matrix acidic phosphoprotein 1) und SPP1 (secreted phosphoprotein 1). K = Kontrolle, o.D. = osteogen differenziert; D: Semiquantitative PCR von cDNA aus Zellen unter 2tägigem FCS-Entzug (-) verglichen mit Zellen in hMSC-TERT-Medium mit 10% FCS (+). Primer für EEF1A1, SAA1, SAA2, MMP1 (matrix metallopeptidase 1), MMP3 (matrix metallopeptidase 3), und PSG5 (pregnancy specific beta-1-glycoprotein 5) wurden verwendet.

Ergebnisse

5.2.4

HELLS – Expressionsmuster während der in-vitro-Alterung von hMSC

Die Mikroarray-Analysen zur Seneszenz zeigten, dass die Lymphoid-spezifische Helikase HELLS in seneszenten hMSC bis zu 5,26fach geringer exprimiert wird als in P1 (FC = 0,19) (Tab. 15). Die Evaluierung der Mikroarray-Daten mittels semi-quantitativer PCR konnte diese verringerte Expression in 3 von 5 hMSC-Chargen bestätigen (Tab. 10). Um die Expression während des gesamten Verlaufs der in-vitro-Alterung zu untersuchen, wurde semiquantitative PCR von HELLS an cDNA aus jeder Passage von 5 weiteren hMSC-Populationen durchgeführt (Abb. 31A). Anschließende densitometrische Auswertung zeigte, dass HELLS in P1 nur geringfügig exprimiert wird, und daher kaum eine Genexpressionsänderung zwischen P1 und Px festzustellen ist. Die Expression steigt jedoch in P2-5 (abhängig von der jeweiligen hMSC-Population) an und nimmt im weiteren Verlauf der in-vitro-Alterung wieder ab. Dieses Expressionsmuster konnte trotz Spendervariabilität in allen 5 hMSC-Populationen beobachtet werden.

HELLS im Verlauf der in-vitro-Alterung

Relative Genexpression in Prozent

500%

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15

400% 300% 200% 100% 0%

hMSC613

hMSC574

hMSC622

hMSC625

CDKN2A im Verlauf der in-vitro-Alterung

200%

Relative Genexpression in Prozent

hMSC614

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15

150%

100%

50%

hMSC613

hMSC614

hMSC574

hMSC622

hMSC625

PSG5 im Verlauf der in-vitro-Alterung

Relative Genexpression in Prozent

6000% P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15

5000% 4000% 3000% 2000% 1000% 0%

hMSC613

hMSC614

hMSC574

hMSC622

hMSC625

Ergebnisse

POU5F1 im Verlauf der in-vitro-Alterung

Relative Genexpression in Prozent

500%

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15

400% 300% 200% 100% 0% hMSC613

Relative Genexpression in Prozent

hMSC614

hMSC574

hMSC622

hMSC625

BMI1 im Verlauf der in-vitro-Alterung

250%

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15

200% 150% 100% 50% 0% hMSC613

hMSC574

hMSC622

hMSC625

FAS im Verlauf der in-vitro-Alterung

250%

Relative Genexpression in Prozent

hMSC614

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15

200% 150% 100% 50% 0% hMSC613

hMSC614

hMSC574

hMSC622

hMSC625

Abb. 31 Expressionsmuster ausgewählter Gene im Verlauf der in-vitro-Alterung von 5 hMSC-Populationen. Densitometrische Auswertung von semi-quantitativen PCR-Ansätzen mit Primern für A: HELLS (lymphoid-specific helicase), B: CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), C: PSG5 (pregnancy specific beta-1-glycoprotein 5), D: POU5F1 (POU class 5 homeobox 1, OCT4), E: BMI1 (BMI1 polycomb ring finger oncogene) und F: FAS (Fas [TNF receptor superfamily, member 6]). Es wurden cDNA-Proben aus jeder Passage der 5 hMSC-Populationen verwendet, die letzte Passage bezeichnet jeweils die seneszente Passage. Die Daten wurden auf das Haushaltsgen EEF1A1 (eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1) normalisiert. Für die relative Genexpression HELLS, PSG5, BMI1, POU5F1 und FAS wurden die normalisierten Densitometriewerte für P1 auf 100% gesetzt und alle anderen Genexpressionswerte dazu ins Verhältnis gestellt. Da in frühen Passagen keine CDKN2A-Expression detektiert werden konnte, wurde für diese Passagen eine Expression von 0% festgelegt. Die Densitometrie-Werte für CDKN2A wurden für Px auf 100% gesetzt und alle anderen Genexpressionswerte dazu ins Verhältnis gestellt.

Um mögliche Zusammenhänge mit dem Genexpressionsmuster von Seneszenzmakern feststellen zu können, wurden ebenfalls PCR-Analysen von CDKN2A (Abb. 31B) und PSG5 (Abb. 31C) durchgeführt. Es zeigte sich, dass CDKN2A in frühen Passagen nicht exprimiert wird und in 3 von 5 hMSCPopulationen in Px abrupt ansteigt. Die PSG5-Expression steigt bereits sehr früh sehr stark, in 2

Ergebnisse hMSC-Populationen sogar schon in P2 bzw. P3. Nur in einer hMSC-Population konnte eine Abnahme der PSG5-Expression ab P2 im Verlauf der in-vitro-Alterung beobachtet werden (hMSC613). Weitere Gene, die in der Literatur in Zusammenhang mit HELLS gebracht werden bzw. deren Expression von HELLS reguliert wird, wurden ebenfalls untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression von POU5F1 (OCT4) dem Verlauf der HELLS-Expression entspricht (Abb. 31D). Die Expression des p16-Inhibitors BMI1 und des Rezeptors FAS nimmt nur geringfügig in späten Passagen ab, diese Abnahme konnte aber in allen 5 hMSC-Populationen gezeigt werden (Abb. 31E und F). Die FAS-Expression ist in 3 der 5 Spender in Px ca. 2fach geringer als in P1.

Abb. 32 Schematische Zusammenfassung der Daten zur Genexpression im Verlauf der in-vitro-Alterung. Die Passagenanzahlen der 5 hMSC-Populationen aus Abb. 31 wurden in je 5 Abschnitte eingeteilt und aus jedem Abschnitt der Densitometriewert einer Passage verwendet, um die relative Genexpressionsänderung im Verhältnis zu P1 zu ermitteln (FC=PAbschnitt/P1). Abschnitt 1 und Abschnitt 5 bezeichnen dabei P1 bzw. die seneszente Passage Px. Es wurden Mittelwerte aus den relativen Genexpressionsänderungen aller 5 hMSC-Populationen für die Gene HELLS, PSG5, CDKN2A, BMI1, POU5F1 und FAS gebildet.

Die Abb. 32 zeigt die schematische Zusammenfassung der densitometrischen Daten zu HELLS, CDKN2A, PSG5, POU5F1, BMI und FAS aller 5 hMSC-Populationen. Da alle hMSC-Populationen unterschiedlich viele Passagen bis zur Seneszenz durchliefen (8-15 Passagen), wurde jede einzelne Population in 5 Abschnitte eingeteilt. Abschnitt 1 und Abschnitt 5 bezeichnen dabei P1 bzw. Px, innerhalb der restlichen Abschnitte wurde die cDNA einer Passage blind gewählt, um eine Vergleichbarkeit der Daten von mehreren hMSC-Populationen zu ermöglichen. Anschließend wurde von jeder Population die relative Genexpression ermittelt (FC = PAbschnitt/P1) und die Mittelwerte zu jedem Abschnitt aus allen 5 hMSC-Populationen gebildet.

Ergebnisse Da es sich um semi-quantitative Analysen handelt, kann die Höhe der Genexpression verschiedener Gene nicht miteinander verglichen werden. Allein der Verlauf der Genexpression ist in Abb. 32 aussagekräftig. Es wird nochmals verdeutlicht, dass die Expression von PSG5 viel früher anstieg als die Expression des zweiten Seneszenzmarkers CDKN2A. Das Genexpressionsmuster von HELLS und POU5F1 war nahezu identisch. BMI1 und FAS zeigten kaum Genexpressionsänderungen im Verlauf der in-vitro-Alterung. Da es sich um die Mittelwerter aller 5 hMSC-Populationen handelt, gehen individuelle Spendervariabilitäten verloren, wie besonders deutlich beim Expressionsmuster von FAS zu beobachten ist. Um das Protein in mesenchymalen Stammzellen zu lokalisieren, wurde die immortalisierte Zelllinie hMSC-TERT heran gezogen. HELLS war fast ausschließlich in den Nuklei der Zellen zu finden, dort jedoch in unterschiedlicher Menge, wie die variierenden Fluoreszenz-Intensitäten in Abb. 33A und B zeigen. Des Weiteren war HELLS während der Zellteilung (Abb. 33A) aber auch noch kurz darauf (Abb. 33B) im Cytoplasma lokalisiert.

Abb. 33 Immuncytochemischer Nachweis von HELLS in hMSC-TERT. Der Nachweis des Proteins erfolgte mit spezifischem anti-HELLS Primärantikörper in hMSC-TERT (A, B). Die Inkubationen mit Rabbit IgG (C) und Sekundärantikörper allein (D) dienten als Kontrollen für die Spezifität des anti-HELLS Antikörpers.

5.3 Kandidatengene der Osteoporose 5.3.1

Kandidatengensuche

Der Vergleich des Transkriptoms von hMSC-OP mit hMSC-K mittels Mikroarrays und die anschließende SAM dienten dem Zweck, Kandidatengene zu identifizieren, die in hMSC eine Rolle bei der Entstehung von Osteoporose spielen könnten. Um aus der Fülle an Daten geeignete Kandidaten filtern zu können, wurden diese mittels eines Punktesystems und der bekannten wissenschaftlichen Literatur nochmals bereinigt. Dabei wurde analog der Punktevergabe des Genexpressionsvergleichs von hMSC-seneszent mit hMSC-K vorgegangen (siehe 5.2.2). Es wurde – wie oben beschrieben – die Stringenz der Genexpression angehoben, indem nur Genprodukte mit einem q-Wert < 10% und FC < 0,5 bzw. > 2 als differentiell exprimiert angesehen wurden. 92

Ergebnisse Die Anzahl an differentiell exprimierten Probesets pro Gen, sowie die exklusive Expression in hMSC-K bzw. hMSC-OP wurde bewertet. Ebenso wurden Punkte für die Höhe des FC vergeben (Tab. 17). Tab. 17 Punktevergabe für Höhe des Foldchange (FC) in SAM von hMSC-OP versus hMSC-K

Punkte

FC (hMSC-OP/ hMSC-K FC ab < 0,5

FC ab > 2

0 2

> 0,4 > 0,3333

< 2,5 0,2

0,1

< 10

< 0,1

> 10

Die Summe aus all diesen Punkten diente als erstes Auswahlkriterium. Die besten 100 Gene der höher, sowie der geringer exprimierten Gene in hMSC-OP wurden in einer Literaturrecherche hinsichtlich ihrer bisher bekannten Funktion untersucht. Je nachdem welche Bedeutung den jeweiligen Genen in diesen Kategorien zukam, wurden – wie oben beschrieben – Punkte verteilt (siehe 5.2.2). Zusammen mit der vorangegangenen Bewertung wurde die totale Summe berechnet. In Tab. 18 sind auszugsweise nur die 25 Gene mit der höchsten totalen Summe für erniedrigte bzw. erhöhte Expression in hMSC-OP aufgeführt. Die vollständige Liste mit 200 Genen befindet sich im Anhang (Tab. 34). Im Falle von mehreren Probesets pro Gen sind nur jene mit dem niedrigsten bzw. höchsten FC in den Listen aufgeführt. Da aufgrund des Altersunterschieds der Spender von hMSC-OP und hMSC-K nicht definiert werden kann, welche differentielle Genexpression aufgrund des Alters und welche aufgrund der Osteoporose hervor gerufen wird, wurden jene Gene, die auch in den Mikroarray-Analysen von hMSC-alt versus hMSC-K in die gleiche Richtung differentiell exprimiert wurden, markiert. Eine PCR-Evaluierung mit RNA-Proben von hMSC-alt und hMSC-OP wäre bei diesen Genen nötig, bevor sie als definitive Kandidaten der Osteoporose in Frage kommen würden. Tab. 18 Rangliste der besten 50 Kandidatengene für osteoporotische hMSC Gen Symbol

ProbesetPunkte

Gen Name FC

q (%)

Exklusive Exp.

FCPunkte

Literatur-Punkte Alter ung

Knoch en

total

Osteo porose

IGF2

insulin-like growth factor 2

6,39

3,21

FOXC2

forkhead box C2

2,89

0,62

MAB21L2

mab-21-like 2

14,43

0,00

SOST

sclerosteosis

7,30

2,18

IBSP

integrin-binding sialoprotein

5,72

0,00

CALR

calreticulin

2,62

1,60

ITGB2

integrin, beta 2

2,94

0,62

NOTCH3

Notch homolog 3

2,90

0,90

EGR2

early growth response 2

5,97

0,62

ANGPTL4

3,69

7,26

3,00

2,70

BCL2

angiopoietin-like 4 parathyroid hormone 1 receptor B-cell CLL/lymphoma 2

2,71

8,24

PML

promyelocytic leukemia

2,70

1,40

SDC3

syndecan 3

3,41

1,60

PTH1R

gleich in hMSCalt

Ergebnisse

BMP8B COL10A1

Bone morphogenetic protein 8b collagen, type X, alpha 1

6,29

3,54

5,25

0,00

3,40

1,60

3,34

0,62

3,11

2,46

2,91

2,70

3,80

1,33

2,88

0,90

2,83

4,38

2,77

4,93

ZNF208

follistatin-like 3 neuroblastoma, suppression of tumorigenicity 1 DNA-damage-inducible transcript 4 prostaglandin D2 synthase 21kDa polycystic kidney disease 1 synuclein, alpha interacting protein enolase 2 transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 2 zinc finger protein 208

6,33

0,62

NOX4

NADPH oxidase 4

0,35

4,38

PENK

0,34

5,70

0,31

4,38

0,20

4,38

0,28

5,70

MEOX2

proenkephalin SH3-domain binding protein 2 regulator of G-protein signaling 4 Suppressor of zeste 12 homolog mesenchyme homeobox 2

0,24

0,00

LXN

latexin

0,45

4,38

TUBB2A

tubulin, beta 2A cell division cycle associated 8 forkhead box M1 Kallmann syndrome 1 sequence sodium channel, voltagegated, type III, alpha subunit protein kinase inhibitor beta mal, T-cell differentiation protein-like Zic family member 1

0,48

3,90

0,48

9,04

0,40

6,30

0,10

9,04

0,10

9,04

0,12

1,33

0,13

4,38

0,13

4,38

contactin 3 coagulation factor II F2RL1 receptor-like 1 CHI3L1 chitinase 3-like 1 split hand/foot SHFM1 malformation type 1 microfibrillar associated MFAP5 protein 5 pyrimidinergic receptor P2Y, P2RY6 G-protein coupled, 6 heterogeneous nuclear HNRNPUL2 ribonucleoprotein U-like 2 EMX2 empty spiracles homeobox 2

0,13

1,60

0,18

2,18

0,22

4,38

0,45

1,90

0,26

4,93

0,34

2,18

0,35

1,90

0,36

4,38

PCDHB5

protocadherin beta 5

0,37

7,26

HOXB3

homeobox B3

0,38

6,30

FSTL3 NBL1 DDIT4 PTGDS PKD1 SNCAIP ENO2 TRPM2

SH3BP2 RGS4 SUZ12

CDCA8 FOXM1 KAL1 SCN3A PKIB MALL ZIC1 CNTN3

Es wurde ein Wertigkeitssystem entwickelt, um mögliche Kandidatengene der Osteoporose aus den MikroarrayErgebnissen von hMSC-OP versus hMSC-K zu ermitteln. Für alle Gene, deren Probesets einen q-Wert < 10% und eine Genexpressionsänderung (FC) > 2 bzw. < 0,5 aufwiesen, wurden Punkte vergeben für die Anzahl an differentiell exprimierten Probesets, die eventuell vorhandene, exklusive Expression und die Höhe des FC. Eine Literaturrecherche hinsichtlich der Funktion der Gene in Knochenmetabolismus, Alterung/Seneszenz und Osteoporose wurde ebenfalls bewertet. Die totale Summe aus diesen Punkten dient als Richtwert der betreffenden Gene für deren mögliche Bedeutung für die Entstehung von Osteoporose. Pro Gen ist jeweils nur jenes Probeset mit der höchsten differentiellen Genexpressionsänderung angegeben. Gene, die in den Mikroarray-Daten zu hMSC-alt versus hMSC-K ebenfalls in die gleiche Richtung differentiell exprimiert waren, wurden mit x markiert. Gene, die in semi-quantitativen PCR-Ansätzen (Tab. 10) nicht nachgewiesen werden konnten (z.B. Hells), wurden aus der Liste heraus genommen. Rote Markierung: mindestens zweifach erhöhte Genexpression in hMSC-OP im Vergleich zu hMSC-K (FC ≥ 2); grüne Markierung: mindestens zweifach erniedrigte Genexpression in hMSC-OP im Vergleich zu hMSC-K (FC ≤ 0,5).

Ergebnisse Das Gen MAB21L2 ist ein Kandidat, der sowohl in hMSC-alt als auch hMSC-OP höher exprimiert wird, wie die Mikroarray-Hybridisierungen als auch semi-quantitative PCR-Analysen zeigten (Tab. 9, Tab. 11). Zur weiteren Überprüfung der Mikroarray-Daten wurden semi-quantitative PCR-Analysen mit einer höheren Anzahl an Populationen von hMSC-alt (N=8) und hMSC-OP (N=8) durchgeführt. Es zeigte sich erneut ein signifikanter Unterschied in der MAB21L2-Expression zwischen hMSC-K aus Spendern mittleren Alters und hMSC-OP aus Osteoporose-Patienten hohen Alters mit einer relativen Genexpressionsänderung von 2,67 (Abb. 34). Eine 2,03fach höhere Expression von MAB21L2 in hMSC-OP konnte auch im Vergleich zu hMSC-alt beobachtet werden. Der Unterschied zwischen hMSC-K und hMSC-alt ist weniger eindeutig mit einer Änderung von 1,32, dennoch ist ein Trend zu erkennen. Tendenziell können die Mikroarray-Ergebnisse bestätigt werden: MAB21L2-Expression erhöht sich in hMSC aufgrund des Alters der Spender, ist jedoch in Osteoporose-Patienten nochmals weiter erhöht. Dieses Beispiel zeigt, dass ein von vorn herein absoluter Ausschluss der Alters-assozierten Gene aus den Daten zu osteoporotischen hMSC demnach nicht ratsam wäre.

Genexpression MAB21L2 Relative Genexpression in Prozent [%]

400 350

ØhMSC-K

** **

ØhMSC-alt

ØhMSC-OP

300 250

2,03 a

200

2,67 c

150

1,32 b 100 50 0

Abb. 34 Densitometrische Auswertung der semi-quantitativen PCR zur MAB21L2-Genexpression in hMSC aus Spendern mittleren Alters, älteren und Osteoporose-Patienten. Mittelwerte (Ø) der Genexpressionsstärke von MAB21L2 in hMSC-K (N=9, Spenderalter Ø 47±5,32 Jahre), hMSC-alt (N=9, Spenderalter Ø 76,67±5,87 Jahre) und hMSC-OP (N=8, Spenderalter Ø 83,88±5,87 Jahre) wurden nach Normalisierung auf das Haushaltsgen EEF1A1 (eukaryotic translation elongation factor a 1 alpha 1) ermittelt. Angegeben sind die Standardabweichungen und die relativen Genexpressions-änderungen: = b c ØhMSC-OP/ØhMSC-alt, = ØhMSC-alt/ØhMSC-K und = ØhMSC-OP/ØhMSC-K. Die Signifikanz wurde mittels zweiseitigem Mann-Whitney-U-Test bestimmt: ** p < 0,001.

5.3.2

Sclerostin – prämature Expression in hMSC

In den Mikroarray-Analysen zeigte sich, dass SOST – das Gen des Proteins Sclerostin – in hMSC-OP aus Spendern mit Osteoporose (Alter Ø = 86,2±5,89) 7,3-fach höher exprimiert wird als in den Kontrollzellen (hMSC-K, Alter der Spender: Ø = 57,5±9,56) (Tab. 17). Da in diesem Fall die Spender der osteoporotischen hMSC im Durchschnitt 28,7 Jahre älter waren als die Spender der Kontrollzellen, kann nicht ausgeschlossen werden, dass SOST aufgrund des Alters und nicht aufgrund der Osteoporose ansteigt. Aus diesem Grund wurden weitere PCR-Analysen mit einer größeren Anzahl an hMSC-OP-Populationen (N=8) und hMSC-alt-Populationen (N=9) aus Spendern vergleichbaren Alters durchgeführt, wobei bei den Spendern der hMSC-alt keine Osteoporose bekannt war (Abb. 35). Es zeigt sich sehr deutlich, dass trotz Spendervariabilitäten SOST in hMSC-OP generell höher und in mehreren Zellpopulationen exprimiert wird als in hMSC-alt. Die hMSC aus Spendern mittleren Alters weisen bis auf 3 Populationen keine SOST-Expression auf. 95

Ergebnisse

hMSC-OP

hMSC-alt

hMSC-K

EEF1A1 SOST Abb. 35 Semi-quantitative PCR zur SOST-Expression in hMSC aus Spendern mittleren Alters, älteren und OsteoporosePatienten. Komplementäre DNA-Proben von hMSC-K (Spenderalter Ø 43,25 ± 4,59 Jahre), hMSC-alt (Spenderalter Ø = 72,55±4,90 Jahre) und hMSC-OP (N=8, Spenderalter Ø = 82,63±9,02 Jahre) wurden mit Primern zu SOST (Sclerostin) und EEF1A1 analysiert.

Um zu testen, ob die erhöhte SOST-Expression Einfluss auf die Differenzierungskapazität der Zellen hat, wurden willkürlich 3 hMSC-Populationen (Alter der Spender: Ø = 81,33±5,69 Jahre) und 3 hMSCalt-Populationen (Alter der Spender: Ø = 78,3±3,79 Jahre) aus Spendern vergleichbaren Alters ausgewählt. Die Zellen wurden 4 Wochen lang osteogen differenziert und die Mineralisierung mittels Alizarin Rot S Färbung nachgewiesen (Abb. 36B). Es zeigte sich, dass alle Population im osteogenen Differenzierungsmedium differenzierte, jedoch unterschiedlich stark. Starke Mineralisierung konnte in hMSC650 detektiert werden, während die beiden anderen hMSC-alt-Populationen nur schwach mineralisierten. Bei den hMSC-OP wiesen alle drei Populationen schwache bis leichte Mineralisierung auf. Nach PCR-Analysen stellt sich heraus, dass nur eine hMSC-OP-Population SOST stark exprimiert, eine nur schwach und die dritte keine SOST-Expression aufwies (Abb. 36A). In den hMSC-altKontrollzellen wurde jedoch ebenfalls SOST-Expression in allen 3 hMSC-Population festgestellt. Ein Zusammenhang zwischen SOST-Expresison und Mineralissierungsgrad war nicht ersichtlich.

A EEF1A1

EEF1A1

SOST

hMSC-alt Kontrolle

hMSC-OP

Osteogen differenziert

Kontrolle

Osteogen differenziert

hMSC627

hMSC636 100 µm

100 µm

hMSC606

hMSC676 100 µm

100 µm

hMSC650

hMSC668 100 µm

100 µm

Abb. 36 Osteogene Differenzierung von hMSC-OP und hMSC-alt. 3 hMSC-Populationen (Alter der Spender: Ø = 81,33±5,69 Jahre) und 3 hMSC-alt-Populationen (Alter der Spender: Ø = 78,3±3,79 Jahre) in P1 wurden 4 Wochen in osteogenem Medium bzw. Expansionsmedium (Kontrolle) kultiviert. A: Semi-quantitative PCR-Analyse der hMSC in P1 mit Primern für SOST (Sclerostin) und EEF1A1. Alle PCR-Produkte liefen auf einem Agarosegel und wurden mit ein und derselben Belichtungszeit und -stärke aufgenommen. B: Alizarin Rot S-Färbung der differenzierten Zellen.

Diskussion

6 Diskussion

6.1 Systembiologie versus statistische Aufarbeitung der Mikroarray-Daten In der vorliegenden Arbeit musste ein Kompromiss zwischen der errechneten Signifikanz der Mikroarray-Daten und der Variabilität der individuellen Systembiologie geschlossen werden, da das Setzen einer hohen Stringenz den Verlust möglicher systembiologischer Zusammenhänge bedingte. Genprodukte, die statistisch eine zu hohe Streuung aufwiesen, wurden nicht in die anschließenden, systembiologischen Auswertungen der SAM-Ergebnisse einbezogen. In Abb. 9 diente der NOTCH-Signalweg zur Veranschaulichung und soll im Folgenden repräsentativ für die gesamten Daten der SAM-Analysen stehen. Die Heatmap zeigt, dass durch Setzen von „cutoffs“ (1,5fache Genexpressionsänderung, q < 10%) 65 NOTCH-relevante Genprodukte verloren gingen. Nur die übrig gebliebenen, signifikanten 28 von insgesamt 93 Genprodukten wurden letztendlich in allen darauf folgenden, systembiologischen Untersuchungen verwendet. Eine noch stringentere Betrachtung (2fache Genexpressionsänderung, q < 10%) resultierte sogar in nur 20 Probesets, die kaum mehr Varianzen in der Expressionsstärke aufwiesen und dadurch für sehr hohe Signifikanz sprachen. Je höher die Stringenz gesetzt wurde, desto mehr systembiologische Information ging jedoch verloren. Bei einem q-Wert < 1% und einer 1,5fachen Genexpressionsänderung würden z.B. nur noch 12 von den ursprünglichen 93 NOTCH-relevanten Genprodukten übrig bleiben (siehe Anhang Tab. 19). Übertragen auf die gesamte SAM hätten sich dadurch die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse reduziert und eine systembiologische Auswertung schwierig gestaltet. Auf der anderen Seite würde das Aufweichen der Stringenz dazu führen, dass die Signifikanz der Ergebnisse reduziert wird. In Abb. 9B wurde der q-Wert ohne Beachtung des FC auf < 20% gesetzt, und es zeigten sich vor allem im mittleren Bereich der Heatmap noch deutliche Varianzen in der Stärke der Hybridisierungssignale innerhalb einer hMSC-Gruppe. Dieser mittlere Bereich enthielt vor allem Genprodukte mit FC nahe 1, also ohne signifikante Genexpressionsänderung (siehe Anhang Tab. 19). In der vorliegenden Arbeit wurden nur differentiell exprimierte Genprodukte mit einer mindestens 1,5fachen Genexpressionsänderung (FC < 0,667 bzw. FC > 1,5) und einem q-Wert von < 10% für die systembiologischen Analysen verwendet. Diese Stringenz wies am Beispiel von NOTCH-relevanten Genprodukten zwar einige, wenn auch geringe Varianzen zischen den hMSC-Populationen auf, reduzierte die systembiologische Aussagekraftkraft aber nicht so extrem wie stringentere Betrachtungsweisen. In Abb. 9 konnte gezeigt werden, dass die Genexpressionsänderung umso höher ist, je geringer der q-Wert gesetzt wird (Vergleich B und C), da ein hoher FC auf eindeutigere Änderungen schließen lässt und die Möglichkeit eines Zufallsergebnisses reduziert. Die Evaluierungen der SAM-Ergebnisse zeigten ebenfalls, dass Genexpressionsänderungen, die in den Mikroarray-Analysen q-Werte bis 10% aufwiesen auch mittels semi-quantitativer PCR bestätigt werden konnten (siehe Abschnitte 5.1.2.3, 5.1.3.3 und 5.1.4.3). All dies bekräftigt die Signifikanz des gewählten „cut-offs“. Dass aufgrund der Stringenz systembiologische Informationen verloren gingen, ist jedoch nicht auszuschließen, sollte aber aufgrund der Wahl eines relativ geringen Mindestwertes an Genexpressionsänderung von 1,5fach gering ausfallen.

Diskussion

6.2 In-vivo-Alterung 6.2.1

In-vivo-Alterung verändert das Genexpressionsmuster in hMSC

Der Vergleich der Mikroarray-Daten von hMSC aus älteren Spendern (hMSC-alt, Ø 81,75±4,86 Jahre, N=4) mit Kontrollzellen aus Spendern mittleren Alters (hMSC-K, Ø 57,6 ± 9,56 Jahre, N=5) mit Hilfe von SAM erbrachte einen großen Unterschied im Genexpressionsmuster obwohl die Donoren durchschnittlich nur 25,15 Jahre Altersunterschied aufwiesen. Erstaunlich viele Genprodukte (3381) sind mindestens 1,5fach geringer in hMSC-alt exprimiert als in hMSC-K, und 1429 Genprodukte sind höher exprimiert nach in-vivo-Alterung der hMSC. Die Analyse der in-vivo-Alterung von hMSC wurde auch von einer anderen Arbeitsgruppe durchgeführt (Wagner et al. 2009) und dabei wurden deutlich weniger differentiell exprimierte Probesets gefunden als in der vorliegenden Arbeit, obwohl der Altersunterschied zwischen den Spendern deutlich höher lag (21-25 Jahre versus 80-92 Jahre, jeweils N=4). Jedoch wurde eine andere Art der statistischen Auswertung der Mikroarray-Daten verwendet als SAM. In der vorliegenden Arbeit wurde die Signifikanz der differentiellen Genexpression festgesetzt mit FC > 1,5 bzw. FC< 0,667 und einem q-Wert < 10%. Des Weiteren wurden alle Probesets, die mindestens in einer der beiden Ver-gleichsgruppen (hMSC-alt oder hMSC-K) zu 50% „present“ waren, einbezogen. Die Arbeitsgruppe um Wagner hat nur jene Probesets analysiert, die in mindestens 50% der Zellen beider Vergleichs-gruppen ein Hybridisierungssignal zeigten. Auch der q-Wert wurde von dieser Arbeitsgruppe unab-hängig vom FC auf stringentere 1% gesetzt. Für die Kultivierung der hMSC aus Hüftköpfen wurde ebenfalls ein anderes Kulturmedium als in der vorliegenden Arbeit verwendet, wie in Wagner et al., 2008 beschrieben und in Abschnitt 6.3.3 näher erklärt. Des Weiteren wurde RNA aus P1 für die Hybridisierungen verwendet, Wagner et al. verwendeten 2009 RNA aus P2, die Zellen durchliefen somit zweimal eine Trypsinierung. All diese Unterschiede lassen darauf schließen, dass Kultivierungsmethoden der Zellen, sowie Art und Weise der Auswertung der Mikroarray-Daten unterschiedliche Ergebnisse liefern kann. Die Kultivierungsdauer und die Häufigkeit von Trypsinbehandlungen und Neuaussaat könnten ebenfalls Einfluss auf das Genexpressionsmuster ausüben. Die geringe Stringenz für die Auswertung der Mikroarraydaten in dieser Arbeit wurde gewählt, um möglichst viele funktionelle Cluster für die Systembiologische Analyse mittels GOstat detektieren zu können, und um zu vermeiden, dass wichtige Signalwege und funktionelle Cluster aufgrund zu hoher Stringenz nicht detektiert werden. Für die Kandidatengensuche (siehe unten) wurden stringentere Bedingungen angesetzt, um eindeutige Kandidatengene herausfiltern zu können, bei denen sich eine funktionelle Untersuchung lohnt. 6.2.1.1

Reproduzierbare Genexpressionsänderungen trotz Spendervariabilität

Die Arraydaten wurden mittels semi-quantitativer PCR evaluiert, indem RNA von 4 hMSC-altPopulationen verwendet wurde, die auch in den Mikroarray-Analysen Verwendung fanden. Da von den Kontrollzellen keine RNA mehr vorhanden war, wurde RNA aus hMSC von 11 anderen Spendern mittleren Alters verwendet. Diese Spender waren durchschnittlich nochmals 7 Jahre jünger als jene, deren hMSC für die Mikroarray-Hybridisierungen heran gezogen wurden. Es zeigte sich, dass die Genexpressionsänderung nur in 58,33% der 12 untersuchten Gene tendenziell den SAM-Ergebnissen entsprach (Tab. 9). Alterung ist jedoch ein komplexer Prozess und unterliegt unterschiedlichsten Einflüssen. Die Ergebnisse der biologischen Evaluierung könnten aufgrund der Verwendung von nur 4 hMSC-altPopulationen, oder aufgrund von unbekannten Grunderkrankungen der Spender der hMSC-K variabel ausgefallen sein. Die hohen Standardabweichungen könnten ebenfalls auf unbekannte Krankheiten der Patienten zurückzuführen sein (Abb. 12). Andere Arbeitsgruppen zeigten bereits hohe Spendervariabilität bei der Analyse von Genexpressionsmustern aus Zellen verschiedener Donoren (Wagner et al. 2009; 98

Diskussion Wagner et al. 2010). Diese spenderabhängigen Unterschiede sind ebenfalls in der Heatmap zu den Mikroarraydaten auffällig (Abb. 13). Das Expressionsmuster der MAP4-Probesets ist sehr unterschiedlich, daher konnte das Gen auch nicht als differentiell exprimiert in der PCR-Analyse detektiert werden. Die erniedrigte MMP3-Expression in hMSC-alt konnte nicht nachgewiesen werden, da nur ein einzelner Spender der hMSC-K-Populationen (hMSC296) MMP3 sehr hoch exprimiert. Die hohe Expression des Gens ist jedoch nicht universell, wie die PCR-Analysen letztendlich zeigten. TP53 ist laut der SAM-Ergebnisse geringer in hMSC-alt exprimiert. Die Heatmap zeigt jedoch, dass vor allem hMSC353 der hMSC-K-Gruppe sehr stark TP53 exprimiert, während das Expressionslevel aller anderen hMSC-Populationen relativ einheitlich ist. Mittels semi-quantitativer PCR konnte nachgewiesen werden, dass TP53 jedoch in hMSC aus älteren Personen höher exprimiert wird. Dies ist konform mit Literaturbefunden zu in-vivo-gealterten hMSC und dem einhergehenden, erhöhtem TP53-Proteinlevel (Stolzing and Scutt 2006). Es ist anzunehmen, dass auch die Patienten der Kontrollgruppe, die für Mikroarray-Analysen verwendet wurden, sehr hohe Spendervariabilitäten aufwiesen, besonders ersichtlich bei Genprodukten, die in hMSC-alt geringer exprimiert werden als in hMSC-K (Abb. 13). Wagner et al. zeigten 2009, dass die Unterschiede zwischen Spendern hohen Alters (80-92 Jahre) sehr deutlich sind zu Spendern geringen Alters (21-25 Jahre). Die in dieser Arbeitsgruppe untersuchten 3 hMSC-Populationen mittleren Alters (50-55 Jahre) wiesen jedoch ebenfalls hohe Spendervariabilitäten auf. Es ist anzunehmen, dass diese Altersgruppe aufgrund des Eintritts in die Menopause zu individuellen Zeitpunkten zumindest bei Frauen das Genexpressionsmuster von hMSC stark beeinflussen kann, da ab diesen Zeitpunkt starke Veränderungen des Knochenmetabolismus stattfinden (Duque 2008; Sahin et al. 2011). Dies könnte einen Grund für die starke Heterogenität im Genexpressionsmuster in diesen hMSC-Populationen darstellen. Erste Eindrücke vermittelte diese Analyse der in-vitro-Alterung mittels hMSC-Kontrollen aus Spendern mittleren Alters dennoch. Um eindeutigere Ergebnisse zu erzielen, müssten hMSC aus Spendern deutlich jüngeren Alters (< 20 Jahre) isoliert werden. Dies war aufgrund mangelnder Patientenverfügbarkeit für diese Arbeit jedoch nicht möglich. 6.2.1.2

Eingeschränkte Funktion von in-vivo-gealterten hMSC

Die Einteilung der differentiell exprimierten Genprodukte in GO-Gruppen erbrachte, dass der Ablauf des MAPK- und JNK-Signalweges in hMSC aus älteren Spendern gestört ist (Abb. 11). Überrepräsentativ viele Gene, die für die positive Regulation dieser Signalwege beitragen (siehe Anhang Tab. 21), sind in hMSC-alt geringer exprimiert. Der MAP-Kinase-Signalweg, vor allem jener über MEKK2 (MAP3K2) aktiviert wiederum den JNK-Signalweg. Letzterer wird aber u.a. auch über den nicht-kanonischen WNT-Signalweg eingeleitet (Almeida et al. 2005) und die geringere Expression von WNT5B (Tab. 13) deutet auf eine Reduktion dieses WNT-Signalweges hin, da die autokrine Stimulation verloren geht (Hardy et al. 2008). Auch der canonische WNT-Weg scheint gestört, da LRP5 – der Corezeptor für WNT-Moleküle – im Alter auf mRNA-Ebene geringer exprimiert wird. Dies kann letztendlich zu geringerer Knochenformation führen, aufgrund von reduzierter Proliferation und Differenzierungskapazität der hMSC durch Störungen im WNT-Signalweg (Kato et al. 2002; Baksh and Tuan 2007). Die WNT1-induzierbaren Gene WISP1 und WISP3 (Brigstock 2003) sind ebenfalls geringer exprimiert, dagegen wierden beta-Catenin (CTNNB1) und die Gene der Rezeptoren FZD7 und FZD6 im Alter höher exprimiert. Dies könnte einen möglichen „Rescue“-Versuch der Zellen darstellen, oder deutet auf eine Aktivierung des kanonischen WNT-Signalweges hin, nachdem der nicht-kanonische reduziert vorliegt. Da die Aktivierung von MAPK-Signalkaskaden häufig als Antwort auf zellulären Stress oder DNASchädigung folgt, könnte eine reduzierte Genexpression der involvierten Proteine zu einer reduzierten Response auf diese Signale in gealterten hMSC führen (Fanger et al. 1997). Des Weiteren gibt es Hinweise darauf, dass in in-vivo-gealterten hMSC ein starres Aktin-Cytoskelett vorliegt und somit eine reduzierte Fähigkeit zur Migration. Aktin-Filamente werden durch Polymeri99

Diskussion sation von Aktin-Untereinheiten an einem Ende der Filamente gebildet. Gleichzeitig erfolgt die Depolymerisation am anderen Ende der Aktin-Filamente, wodurch das Aktin-Cytoskelett eine hohe Dynamik aufweist. Diese Dynamik scheint gestört, da nach GOstat-Analysen gezeigt werden konnte, dass Gene für die Bildung der Aktinfilamente überrepräsentativ häufig höher exprimiert werden, Gene für Proteine der Depolymerisation hingegen geringer exprimiert werden. Die Funktion des höher exprimierten Gens zu EPLIN (LIMA1) wird als essentiell für die Stabilisierung von Aktinfilamenten beschrieben (Han et al. 2007), während die geringer exprimierten Proteine Gelsolin (GSN), Supervillin (SVIL) und CAPG essentiell für die Migration sind (Anhang Tab. 21) (Cooper and Schafer 2000; De Corte et al. 2004; Crowley et al. 2009). Ein weniger dynamisches Aktin-Cytoskelett wurde für MSC aus gealterten Ratten im Vergleich zu jungen Ratten bereits beschrieben (Kasper et al. 2009). Überrepräsentativ häufig konnten auch geringer exprimierte Gene der GO-Gruppe Spindel zugeordnet werden. Die gleichzeitig verringerte Expression von vielen Cyclinen (Tab. 13) deutet auf geringere mitotische Aktivität in in-vivo-gealterten hMSC hin (siehe auch 6.3.4) (Kong 2003). Gene, die für Präosteoblasten spezifisch sind – IBSP, RUNX2 und COL1A1 (Komori 2010) – sind in gealterten hMSC geringer exprimiert. Da hMSC zumindest in-vivo in ihrer Nische asymmetrische Teilungen durchlaufen (Kassem and Abdallah 2008), könnte dies dafür sprechen, dass hMSC auch in Kultur Mischpopulationen bilden aus Stammzellen und teilweise differenzierten Zellen (Fuchs et al. 2004). In hMSC aus älteren Patienten ist diese Differenzierungskapazität z.T. gestört, wie die geringere Expression von Präosteoblasten-Markern im Vergleich zum Genexpressionsmuster der hMSC jüngerer Spender (hMSC-K) zeigt. Nicht nur der WNT-Signalweg, sondern auch der BMP-Signalweg ist in hMSC-alt betroffen. Der noch wenig bekannte Antagonist zu BMP4 – MAB21L2 – ist auf mRNA-Ebene im Alter höher exprimiert, ebenso SMAD1. MAB21L2 wirkt als Transkriptionsrepressor über die Bindung von SMAD1, wodurch die Signalgebung von BMP4 über SMAD1 unterbunden wird (Baldessari et al. 2004). Das Gen eines weiteren Inhibitors des BMP-Signalweges – Noggin (NOG) – wird höher exprimiert, während GREM1 geringer exprimiert wird. Die Signalgebung über BMPs aktiviert u.a. den MAPK-Signalweg (Miyazono 1999) und ist entscheidend für die Osteoblastendifferenzierung und -funktion, sowie die Regulation der Osteoklastogenese (Rawadi et al. 2003; Canalis 2009). Die Expression von Wachstumsfaktoren ist ebenfalls betroffen, VEGFA und VEGFB, sowie TGFB2 und die Rezeptoren TGFBR1 und TGFBR2 sind geringer exprimiert. Auch der FGF-Signalweg scheint betroffen zu sein, während zumindest FGF1 geringer exprimiert im Alter vorliegt, wird die Expression von FGFR3 induziert und von FGFR2 erhöht. Diese erhöhte Expression der Rezeptoren könnte auf einen „Rescue“-Versuch der Zellen schließen lassen. Zusammenfassend kann anhand der Genexpressionsänderungen aufgrund von in-vivo-Alterung angenommen werden, dass sich das osteogene Differenzierungspotential und die Proliferation in hMSC aus älteren Spendern negativ verändert haben. Differentielle Genexpression in vielen, für die Knochenformation entscheidenden Signalwegen führen zu dieser Schlussfolgerung. Auch die Migrationsfähigkeit ist in gealterten Stammzellen reduziert.

6.3 Seneszenz Mesenchymale Stammzellen werden in der regenerativen Medizin immer häufiger für therapeutische Zwecke im Sinne von Transplantationen eingesetzt. Zu diesem Zweck müssen die Zellen jedoch zuvor in Kultur genommen und expandiert werden. In-vitro-Kultivierung kann die Zellen aber verändern und über einen längeren Zeitraum auch zur Seneszenz führen, wodurch der therapeutische Effekt zunichte gemacht werden würde. Die vorliegende Arbeit soll dazu beitragen neben den bereits bekannten Seneszenz-Markern weitere Kandidatengene speziell für seneszente hMSC zu finden. Die Analyse der Genexpression hinsichtlich Markergenenen für Seneszenz gilt als 100

Diskussion eine der sichersten Methoden, Seneszenz in hMSC frühzeitig detektieren zu können (Wagner et al. 2010). Dies dient dem Zweck, hMSC in Zukunft vor ihrem therapeutischen Einsatz zuverlässig auf ihre Verwendbarkeit hin testen zu können.

6.3.1

In-vitro-Alterung von hMSC ist ein geeignetes Seneszenz-Modell

Um das Genexpressionsmuster von seneszenten hMSC mit nicht-seneszenten hMSC vergleichen zu können, wurden die Zellen bis zum Proliferationsstopp in-vitro kultiviert. Dabei nahm die Proliferationsrate kontinuierlich ab. Insgesamt durchliefen die Zellen in den Passagen P1 bis Px-1 (vorletzte, noch proliferierende Passage) 11-20 Populationsverdopplungen (Abb. 24). Die Populationsverdopplung zwischen Isolationszeitpunkt und P1 konnte nicht ermittelt werden, Wagner et al., 2008, setzten für diesen Zeitraum geschätzte 7-9 Populationsverdopplungen fest. In der seneszenten Passage Px proliferierten die Zellen kaum mehr. Wenn in Px also eine geschätzte Populationsverdopplung von 1 festgelegt wird, dann durchliefen die hMSC während der in-vitro-Alterung 19-30 Populationsverdopplungen. Dies stimmt überein mit den Expansionsexperimenten anderer Arbeitsgruppen (Stenderup et al. 2003; Wagner et al. 2008). Ein Unterschied in der Proliferationsgeschwindigkeit der hMSC aufgrund des Spenderalters konnte nicht festgestellt werden. Jedoch unterschieden sich die Spender nur maximal um 24 Jahre, eine zu geringe Spanne, um den Effekt des in-vivo-Alters zu untersuchen. Dass die Zellen in Px wirklich seneszent waren, konnte nach einem Vergleich von Zellen in P1 anhand der vergrößerten, breiteren Form der Zellen, sowie positiver SA-β-Gal-Färbung bewiesen werden (Abb. 26C, Abb. 27C) (Sethe et al. 2006; Wagner et al. 2008; Wagner et al. 2010). Ein weiterer, anerkannter Marker für Seneszenz ist die Expression von P16 (Bringold and Serrano 2000), die in seneszenten Zellen auf Proteineben mittels Western-Blot-Analysen und immuncytologischer Färbung gezeigt werden konnte (Abb. 25). Die anschließenden Mikroarray-Untersuchungen der hMSC-seneszent (siehe 6.3.3) zeigten zudem, dass 4 der 5 als universelle Seneszenz-Marker beschriebenen Gene auch in dieser Arbeit differentiell exprimiert vorliegen (Wagner et al. 2010): CDKN2A (P16) und ARHGAP29 (oder PARG1) sind aufgrund der Seneszenz höher exprimiert, PTN und MCM3 geringer (Tab. 13). Alles in allem ist die in-vitro-Alterung von hMSC als Modell für Seneszenz geeignet. Die für Mikroarray-Analysen verwendeten Zellen befanden sich demnach definitv in einem seneszenten Zustand, im Gegensatz zu den Kontrollzellen in P1.

6.3.2

hMSC zeigen in Kultur bereits früh Anzeichen von Seneszenz

Wie die Proliferationsuntersuchungen zeigten (Abb. 24), nahm die Geschwindigkeit und die Populationsverdopplung ca. ab der Hälfte der Expansionszeit ab. Dies spricht für eine Akkumulation von nicht mehr proliferierenden Zellen ab diesem Zeitpunkt. Ob hMSC bereits früher als in Px Anzeichen von Seneszenz aufweisen, wurde auf mRNA-Eben, sowie auf Protein-Ebene mittels SA-β-Gal-Bestimmung untersucht. Dabei zeigte sich, dass das Gen des Seneszenzmarkers P16 (Bringold and Serrano 2000) – CDKN2A – bereits in mittleren Passagen exprimiert wird, unter anderem sogar stark (Abb. 31: hMSC622, hMSC625). Keine Expression konnte in frühen Passagen detektiert werden, und in 2 von 5 hMSC-Populationen ist die CDKN2A-Expression in Px am höchsten. Endoh et al. beschrieben 2009, dass die Expression von „pregnancy specific beta-1-glycoproteins“ – Plazenta-Proteine, die eigentlich erhöht im Blutserum von Schwangeren gefunden wurden – auch in seneszenten Fibroblasten ansteigt. Die mRNA von 8 der 10 untersuchten PSG lag erhöht in den seneszenten Fibroblasten vor, darunter auch PSG5 und PSG1. In der vorliegenden Arbeit wurde die 101

Diskussion Expression von PSG5 während der in-vitro-Alterung von hMSC als zweiter Seneszenzmarker auf mRNA-Ebene untersucht. Es zeigte sich, dass in 3 von 5 hMSC-Populationen PSG5 bereits sehr stark in P3 bzw. P4 exprimiert wird (Abb. 31). Die Expression nimmt mehr oder minder gleichmäßig, jedoch nur noch gering bis zu Px zu. Die SA-β-Gal-Färbungen (Abb. 26C, Abb. 27C) zeigen, dass die Zellen in der letzten Passage Px eine stark veränderte Morphologie aufweisen und SA-β-Gal-positiv sind. Jedoch zeigt sich ebenfalls, dass auch Passagen im mittleren Abschnitt der Kultivierungszeit SA-β-Gal-positive Zellen aufweisen und im Falle von hMSC614 sogar positive hMSC in P1 zu finden sind. Diesen SA-β-Gal-positiven Passagen (Bsp. hMSC625 P5, Abb. 27C) folgen oft Passagen mit kaum positiven Zellen (Bsp. hMSC625 P6, Abb. 27C). Eine mögliche Erklärung hierfür wäre, dass im Laufe der Passagierung mehr und mehr seneszente Zellen akkumulieren und somit ein heterogener Zellrasen aus noch proliferierenden und nicht mehr proliferierenden Zellen entsteht. Darauf lassen auch die Daten von Wagner et al. 2008 schließen. Während der Passagierung scheinen die seneszenten Zellen verloren zu gehen, nur proliferierende Zellen adhärieren möglicherweise mit der Oberfläche der Kulturflaschen, wodurch in der folgenden Passage keine seneszenten Zellen mehr zu finden sind. Dass die hMSC614 (Spenderalter: 53 J.) in P1 bereits SA-β-Gal-positive Zellen aufweisen – zumindest mehr als hMSC625 P1 (Spenderalter: 70 J.) – scheint unabhängig vom Spenderalter zu sein, da der Spender von hMSC614 17 Jahre jünger ist als der Donor von hMSC625. Auch wird SA-β-Gal-Färbung für die Untersuchung der in-vivo-Alterung als ungeeignet befunden (Severino et al. 2000) und Stenderup et al. konnten 2003 keinen Unterschied in der SA-β-Gal-Expression zwischen hMSC-Populationen aus Spendern variierenden Alters feststellen. Die quantitative SA-β-Gal-Methode nach Vacanti et al., 2005, lieferte zur SA-β-Gal-Färbung widersprüchliche Befunde (Abb. 26B, Abb. 27B). Messung der SA-β-Gal-Aktivität in 10 µg Gesamtprotein-Lysat ergab, dass die SA-β-Gal-Expression im Verlauf der in-vitro-Alterung einen Bogen vollführt, mit der höchsten Aktivität in mittleren Passagen und keinem Unterschied zwischen P1 und Px. Aufgrund der eindeutigen Befunde der oft als Nachweis von Seneszenz verwendeten SAβ-Gal-Färbung (Dimri et al. 1995; Stenderup et al. 2003; Izadpanah et al. 2008; Wagner et al. 2008) werden die Ergebnisse des SA-β-Gal-Assays nicht weiter in die Analyse einbezogen.

6.3.3

Seneszenz verändert das Genexpressionsmuster in hMSC

Das Genexpressionsmuster von seneszenten hMSC wurde auch von Wagner et al., 2008 untersucht, jedoch wurden die Zellen von dieser Arbeitsgruppe unter anderen Kulturbedingungen expandiert. Abgesehen vom Medium (DMEM-LG und 40% MCDB201), unterschied sich die Kultivierung auch dahingehend, dass Wagner et al. Fibronektin-beschichtete Kulturflaschen verwendeten, sowie den Serumgehalt auf 2% FCS reduzierten und PDGF-bb, sowie EGF als Wachstumsfaktoren zugaben. Wachstumsfaktoren können in Zellen über die Einleitung diverser Signalkaskaden zu oxidativem Stress und Seneszenz führen. Vor allem die Einleitung des RAS-Signalweges – u.a. aktiviert durch die Rezeptoren für EGF und PDGF – ist für diese Entwicklung entscheidend (Serrano et al. 1997; Eswarakumar et al. 2005; Ramos 2008). Wagner et al. zeigten 2008 selbst, dass hMSC ohne Zugabe von Wachstumsfaktoren deutlich länger kultiviert werden konnten, bis sie den Proliferationsstopp erreichten. Des Weiteren wurde beschrieben, dass Serum-Entzug in hMSC unter Kultivierung mit osteogenen Stimuli Adipogenese induziert, im Gegensatz zu hMSC, die in 10% FCS osteogen differenziert wurden und erfolgreich mineralisierten (Ichikawa 2010). Die Konzentration an Serum – selbst xenogenem – ist somit entscheidend für den Erhalt der Funktion von hMSC in Kultur und könnte ebenfalls Einfluss auf die Expansion der Zellen ausüben. In der vorliegenden Arbeit wurde daher das Genexpressionsmuster seneszenter hMSC erneut untersucht, jedoch ohne Einfluss von zusätzlichen Mitogenen und unter Kultivierung mit 10% FCS. Des Weiteren wurden die Mikroarray-Analysen und SAM-Berechnungen mit jeweils 5 hMSCPopulationen durchgeführt; einer weitaus verlässlicheren Anzahl als Wagner et al. verwendeten (N=3). 102

Diskussion 6.3.3.1

Reproduzierbare Genexpressionsänderungen

Der Vergleich der Genexpressionsmuster von hMSC in P1 und hMSC in Px (hMSC-seneszent) erbrachte eine große Anzahl an Genprodukten, die mindestens 1,5fach höher bzw. niedriger in seneszenten hMSC exprimiert werden als in Zellen früher Passagen (Abb. 14). Es ist zu beobachten, dass deutlich mehr Genprodukte in hMSC-seneszent geringer exprimiert (2477) werden als höher (1284). Die Überprüfung der Mikroarray-Ergebnisse mittels semi-quantitativer PCR-Analyse zeigte, dass die differentielle Genexpression in 81,25% der untersuchten Gene bestätigt werden konnte. Dabei ist zu erwähnen, dass es sich bei den Mikroarray-Daten um andere hMSC-Populationen handelte als bei den PCR-Analysen, und das Ergebnis der Arrays demnach universell für seneszente hMSC gilt. Des Weiteren stammte die RNA für die Mikroarray-Hybridisierungen aus 9 verschiedenen Patienten. Nur von einer hMSC-Population (hMSC276) wurden Zellen in P1 als auch Px für die Analyse verwendet. Dies ist ein weiterer Beweis dafür, dass die in-vitro-Alterung von hMSC ein zuverlässiges, artifizielles Modellsystem für die Untersuchung der Seneszenz darstellt. Die Heatmap der Mikroarray-Ergebnisse (Abb. 16) zeigt deutlich, dass jedoch Spendervariabilitäten zu beobachten sind, die auch in der PCR-Analyse auftreten (Tab. 10). Nur bei 11 von 32 untersuchten Genen konnte die differentielle Genexpression in allen 5 hMSC-Populationen detektiert werden. Oft jedoch erfüllten nur 3 von 5 hMSC-Populationen die Erwartungen aus den Mikroarraydaten. Eine weitere Auffälligkeit stellt die exklusive Expression einiger Gene in P1 bzw. Px dar. Die Expression von CDKN2A oder CDH1 (cadherin 1) z.B. wird ausschließlich in hMSC-seneszent (Px) induziert, während die Expression von CA2 oder FGFR2 in einigen hMSC-Populationen ausschließlich in P1 detektiert werden konnte. Diese Gene scheinen reprimiert zu werden. Ob aktiv oder aufgrund eingeschränkter Transkriptionsfähigkeit durch seneszenten Verlust der metabolischen Aktivität der Zellen (Cristofalo et al. 2004; Muller 2009), muss noch geklärt werden. 6.3.3.2

Eingeschränkte Funktion von seneszenten hMSC

Die mindestens 1,5fach differentiell exprimierten Gene aufgrund von Seneszenz wurden einer GOstat-Analyse unterzogen und es zeigte sich, dass seneszente Zellen Defizite in der Proliferation und der Replikation aufweisen, da Gene für GO-Gruppen des Spindelaufbaus, der Mitose, der Mikrotubuli und der Replikationsgabel geringer exprimiert waren (Abb. 15). Diese Ergebnisse entsprechen jenen aus anderen Arbeitsgruppen (Izadpanah et al. 2008; Wagner et al. 2008). Die nähere Betrachtung einzelner Gene zeigt (Tab. 13), dass vor allem die Expression von Genen der Cycline und CDC25-Proteine geringer in seneszenten Zellen vorliegt. Auch Gene, die bereits mit Seneszenz assoziiert wurden, sind differentiell exprimiert. Insgesamt 6 Gene für PSG-Proteine, darunter PSG5 sind höher exprimiert, ebenso weitere Seneszenzmarker (siehe auch 6.3.1), wie CDKN1A, das Gen für P21, einem Zellzyklusinhibitor (Kong 2003). Die PSG-Proteine können somit nicht nur in Fibroblasten (Endoh et al. 2009), sondern auch in hMSC zu den Markern für Seneszenz durch in-vitro-Alterung gezählt werden. Des Weiteren konnten Hinweise für oxidativen Stress gefunden werden, durch erhöhte Expression von SOD2 (superoxide dismutase 2, mitochondrial) und TXNRD1 (thioredoxin reductase 1) (Ebert et al. 2006b; Lu and Holmgren 2009). Für einen Zustand von „inflammaging“ spricht die bis zu 50fach erhöhte Expression von SAA1/SAA2, den sogenannten Akute-Phase-Proteinen (siehe 6.5.1) (Dinarello 2006; Grolleau-Julius et al. 2009). Auch die Migration scheint in diesen Zellen gestört zu sein, wie die reduzierte Expression von Hyaluronsynthasen (HAS1 und HAS2) und HMMR (hyaluronan-mediated motility receptor) andeuten. Hyaluronsäure in der extrazellulären Matrix ist notwendig für die Migration von Zellen, und Tzelloz et al. konnten 2009 bereits die Abnahme der HAS1- und HMMR-Expression in UV-bestrahltem, gealtertem Hautgewebe dokumentieren. HMMR ist ein Rezeptor für Hyaluronsäure, der als essentiell für die Migration in Endothelzellen und Fibroblasten beschrieben wurde (Savani et al. 2001; Tolg et al. 2006). Des Weiteren konnte ein Zusammenhang zwischen erniedrigter HMMR-Expression und

103

Diskussion erhöhter P53-Expression auf Proteinebene festgestellt werden (Sohr and Engeland 2008). Die geringe Expression des Gens in in-vitro-gealterten hMSC ist somit als Seneszenz-Anzeichen zu betrachten. Marker für osteogene Differenzierung und Knochenaufbau, wie z.B. SPP1, ALPL oder BGLAP sind geringer exprimiert in den seneszenten Zellen (Narisawa et al. 1997; Komori 2010). Die verringerte Expression des Gens des Östrogenrezeptors ESR1 könnte auf verringerte Response auf Östradiol in seneszenten hMSC schließen lassen (Riggs et al. 2000; Vanderschueren et al. 2004). Interessanterweise wird das Gen der Vitamin D3 25-Hydroxylase – CYP2R1 – in hMSC-seneszent geringer exprimiert als in hMSC-K. Dies bedeutet zum einen, dass das Enzym nicht nur in der Leber exprimiert wird und dort Vitamin D3 in 25-(OH)D3 umwandelt, sondern auch in den Stammzellen des Knochens, zumindest in frühen Passagen. Bisher war die lokale Expression von CYP2R1 nur in Osteoblasten nachgewiesen (Ichikawa et al. 1995), und hMSC konnte bisher nur die Expression und enzymatische Wirkung der 1-α-Hydroxylase (CYP27B1) zugeschrieben werden (Zhou et al. 2010). Zum anderen scheint aufgrund der Seneszenz CYP2R1 geringer exprimiert zu werden, wodurch die lokale Produktion von 25-(OH)D3 möglicherweise reduziert vorliegt, somit weniger 1,25-(OH)2D3 enzymatisch katalysiert werden kann. 1,25-(OH)2D3 gilt jedoch als Proliferationshemmer, der Zellen in der G0/G1-Phase des Zellzyklus arretieren lässt (Artaza et al. 2010), so wie es in seneszenten Zellen ebenfalls zu beobachten ist. Eine reduzierte 1,25-(OH)2D3-Bildung in hMSC-seneszent, deren Proliferationsstopp und Eintritt in die Seneszenz nachgewiesen wurden, scheinen daher widersprüchliche Befunde darzustellen. Auf der anderen Seit konnte in unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass 1,25-(OH)2D3 die Seneszenz von hMSC in Kultur nicht fördert (Klotz et al. submitted). Dies widerspricht zwar einigen anderen Literaturbefunden, würde aber die hier vorliegenden Mikroarray-Ergebnisse in so weit unterstützen, dass der Zellzyklusarrest auf einen Vitamin D3unabhängigen Wegen in hMSC-seneszent eingeleitet wurde. Um eine endgültige Aussage darüber treffen zu können, muss jedoch noch auf Proteinebene nachgewiesen werden, ob eine geringer Expression von CYP2R1 letztendlich tatsächlich zu einer verringerten Produktion von 1,25-(OH)2D3 führt. Seneszente hMSC scheinen keinen Einfluss auf die Osteoklastogenese auszuüben. Im Gegenteil sind PTGS2 und TNFSF11 sogar geringer exprimiert (Tab. 13). Sezernierte Botenstoffe wie Prostaglandine – synthetisiert von der Prostaglandin-endoperoxid Synthase 2 (PTGS2) – fördern die Transkription von TNFSF11, dem Gen für RANKL (Ryu et al. 2006; Sims and Gooi 2008; Graham et al. 2009b). Das membranständige RANKL auf Osteoblasten und MSC, als auch sezerniertes RANKL regen wiederrum die Osteoklastogenese an (Horwood et al. 1998; Sims and Gooi 2008). Auch Oncostatin M und Il6 können die Expression von RANKL voran treiben. Beide Faktoren wirken über den Rezeptor IL6ST (interleukin 6 signal transducer) (O'Brien et al. 2000; Sims and Gooi 2008), der auf mRNA-Eben in hMSC-seneszent höher exprimiert wird. Da die TNFSF11-Expression jedoch gering ist, könnte dies ein „Rescue“-Versuch der Zellen darstellen. Hinweise auf einen reduzierten, zellulären Metabolismus als eines der Kennzeichen der replikativen Seneszenz liefert die verringerte Expression von Genen vieler Wachstumsfaktoren, u.a. PDGFA, VEGFA, FGF1 und TGFB2. Der IGF-Signalweg scheint besonders negativ beeinflusst zu sein, IGF2 wird geringer exprimiert, und das IGF-Bindeprotein IGFBP5 höher, welches auf Proteinebene IGF bindet, so dass eine Ligandenwirkung auf die IGF-Rezeptoren nicht stattfinden kann und sich dies negativ auf die Knochenformation auswirkt (Canalis 2009). Auch FGFR2, ein entscheidender Rezeptor für die osteogene Differenzierung (Hamidouche et al. 2010), ist geringer exprimiert. Alles in allem konnte bewiesen werden, dass die Art und Weise wie die Mikroarray-Daten zur Seneszenz ermittelt und ausgewertet wurden, korrekt war, denn wie in anderen Literaturquellen bereits gezeigt, sind auf Genexpressionsebene Defizite in der Proliferation zu beobachten. Bekannte Marker für Seneszenz sind ebenfalls auffällig in der vorliegenden Arbeit. Es konnten mit Hilfe dieser Arbeit viele neue Kandidatengene für Seneszenz in hMSC gefunden werden, wie z.B. die stark erhöhte Expression von PSG5, CDH1, IGFBP5 oder SAA1/SAA2 (siehe auch 6.5.1), sowie die reduzierte oder komplett reprimierte Expression von IGF2, HELLS (siehe auch 6.5.2), HMMR oder FGFR2.

104

Diskussion Seneszente hMSC weisen des Weiteren Defizite im osteogenen Differenzierungspotential, sowie der Migration auf. Der Metabolismus ist in diesen Zellen eingeschränkt aktiv und die Osteoklastogenese wird von seneszenten Zellen nicht voran getrieben.

6.3.4

Seneszenz versus Alterung

Replikative Seneszenz ist gekennzeichnet durch einen irreversiblen Proliferationsstopp von Zellen, mit Reduktion von Metabolismus und Zellfunktion, sowie den Verlust der Replikationsfähigkeit (Cristofalo et al. 2004; Muller 2009). Seneszenz stellt somit einen Mechanismus auf rein zellulärer Ebene dar. Die Alterung ganzer Organismen hingegen beschreibt die Reduktion von Organfunktionen und die verringerte Befähigung des Körpers zur Reaktion auf Stress, sowie zur Abwehr von Infektionen und Krankheiten. Der gealterte Mensch ist durch die Anhäufung von Alters-assoziierten Krankheiten, wie Arteriosklerose, Osteoporose, Degeneration des Nervensystems und Krebs gekennzeichnet (Kuro-o 2001; Mimeault and Batra 2009; Sahin and Depinho 2010). Zellen aus gealterten Personen stehen somit unter dem Druck vermehrt Infektionen, Krankheitserreger oder oxidativen Stress abzuwehren. Des Weiteren häufen sich DNA-Schäden oder Mutationen im Alter an (Goukassian et al. 2000; Cabelof et al. 2006; Vijg and Dolle 2007), wodurch die betroffenen Zellen stetig zwischen der Entscheidung zur Tumorentwicklung, Apoptose oder dem Eintritt in den G1-Arrest schwanken (Campisi and d'Adda di Fagagna 2007). Zelluläre Degeneration und Funktionsverlust aber auch unkontrollierte Proliferation und Krebsentwicklung sind zwei mögliche Folgen der in-vivo- Alterung (Maslov and Vijg 2009). Der Vergleich der Mikroarray-Daten von in-vitro- und in-vivo-Alterung sollte dazu dienen, Gene oder Gen-Cluster zu ermitteln, die Aufschluss darüber geben, ob sich hMSC aus älteren Personen bereits einem seneszenten Zustand angenähert haben. Dies soll neue Erkenntnisse darüber liefern, ob die Alterung eines Organismus und der damit zusammenhängende Knochenverlust auf reduzierter Verfügbarkeit multipotenter, funktioneller Stammzellen beruht. 6.3.4.1

Wenige Überlappungen im differentiellen Genexpressionsmuster

Trotz der Wahl einer relativ geringen differentiellen Genexpressionsänderung (1,5fach) beim Vergleich der beiden SAM-Analysen zu hMC-alt und hMSC-seneszent, erzielte der Vergleich nur wenige Gemeinsamkeiten. Insgesamt sind nur 79 Genprodukte erhöht exprimiert und 396 Genprodukte geringer exprimiert in beiden Analysen (Abb. 21). Dies bedeutet, dass nur 5,04% aller in hMSC-alt höher exprimierten Genprodukte (1429) auch in hMSC-seneszent gefunden wurden. Bei der verringerten Genexpression handelt es sich um 11,71% aller in hMSC-alt geringer exprimierten Probesets. Diese geringen Gemeinsamkeiten bestätigen die Ergebnisse von Wagner et al., 2009. Auch diese Arbeitsgruppe hat kaum überlappende Gemeinsamkeiten zwischen in-vitro-Seneszenz und invivo-Alterung gefunden, obwohl generell auch weitaus weniger differentielle Genexpression in invivo-gealterten hMSC detektiert werden konnten als in der vorliegenden Arbeit trotz höherem Altersunterschied (siehe 6.2.1.1). Wagner et al. konnten jedoch zeigen dass es immerhin Tendenzen zur gleich gerichteten Veränderungen auf Genexpressionsebene gibt. Jene Genprodukte, die in den hMSC aus älteren Spendern nach gesetzten Auswahlkriterien differentiell exprimiert waren, zeigten in einer Heatmap ebenfalls ähnliche Genexpressionsänderungen im Verlauf der in-vitro-Alterung, wenngleich statistisch weniger signifikant (Wagner et al. 2009). Dadurch dass in der vorliegenden Arbeit die Stringenzen relativ gering gesetzt wurden (FC > 1,5 bzw. FC < 0,667, q < 10%), konnten zwar relativ wenig, aber dennoch weitaus mehr Gene mit überlappenden Genexpression in hMSC-alt und hMSC-seneszent detektiert werden als bei Wagner et al., 2009.

105

Diskussion Dennoch gilt, dass in-vitro-Alterung ein Modellsystem ist, und dadurch die Seneszenz, die möglicherweise in-vivo entsteht nur ansatzweise widerspiegeln kann. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten hMSC-seneszent waren mindestens 100 Tage in Kultur bis die RNA für MikroarrayAnalysen isoliert wurde. Die RNA von hMSC-alt aus älteren Spendern wurde bereits nach 3-5 Wochen Kultivierung isoliert, ebenso die RNA der Kontrollzellen. Während der in-vitro-Alterung verlieren die Zellen höchstwahrscheinlich ihre in-vivo-Signatur, wodurch ein Vergleich von hMSC-seneszent und hMSC-alt nur als Anhaltspunkt dienen kann, um Gene der Alterung zu detektieren. Ungeachtet der Möglichkeit des Verlustes der in-vivo-Signatur können die vorliegenden Ergebnisse auch darauf schließen lassen, dass die in-vivo-gealterten hMSC nicht in den Zustand der Seneszenz eingetreten sind. Entweder weil die Personen, aus denen die hMSC-alt isoliert wurden mit ihrem durchschnittlichen Alter von 81,75 Jahren (± 4,86) biologisch noch nicht alt genug waren, oder weil Alterung eines Organismus die Ansammlung von Genomdefekten und Mutationen darstellt, die letztendlich zu Proliferationsstopp oder aber zu ungehemmter Proliferation führen kann, zwei komplett gegensätzlichen Mechanismen (Maslov and Vijg 2009). 6.3.4.2

Ähnliche Störungen trotz unterschiedlicher Genexpressionsmuster

Aufgrund der oben beschriebenen Unterschiede zwischen hMSC-alt und dem Modellsystem hMSCseneszent sind Gemeinsamkeiten im differentiellen Genexpressionsmuster umso interessanter und aussagekräftiger. Es zeigte sich mittels GOstat-Analysen, dass die Gruppe geringer exprimierten Genprodukten in beiden SAM-Ergebnissen überrepräsentativ viele Gene für den Spindelaufbau, die Mikrotubuli und der Mitose enthalten (Tab. 12), was auf eine Störung des Zellzyklus schließen lässt. Ebenfalls gemeinsam haben hMSC-seneszent und hMSC-alt die verringerte Expression vieler Cycline (Tab. 13). Seneszenzmarker, wie z.B. PSG, CDKN2A oder HELLS sind in hMSC-alt jedoch nicht differentiell exprimiert. Allein die verringerte Expression von BMI1 als Inhibitor von P16 lässt zusammen mit den genannten Störungen des Zellzyklus auf verringerte Proliferation auch in hMSC aus älteren Personen schließen. Die Migration ist in beiden Systemen betroffen, aber auf unterschiedliche Weise, denn in-vitrogealterte hMSC weisen Defizite in der Hyaluronsäure-vermittelten Zellwanderung auf (siehe 6.3.3.2), während in hMSC-alt ein steifes Aktin-Cytoskelett zeigen (siehe 6.2.1.2). Des Weiteren konnte in beiden Zelltypen die verringerte Expression eines Toll-like Rezeptors – TLR3 bzw. TLR4 – detektiert werden (Tab. 13). Zumindest die Bedeutung von TLR3 wurde in hMSC bereits untersucht, und ein neutralisierender Antikörper gegen den Rezeptor verminderte die Migrationsfähigkeit der Zellen in Kultur (Tomchuck et al. 2008). Auch die Aktivierung von TLR4 wurde kürzlich als bedeutsam für die Zellwanderung beschrieben (Zhou et al. 2011). Die Fähigkeit osteogen zu differenzieren bzw. die Bildung von Präosteoblasten könnte somit in beiden gealterten hMSC gestört sein, wenngleich hMSC-seneszent weit mehr Markergene für Osteoblasten geringer exprimieren als hMSC-alt (Tab. 13). In-vivo-gealterte hMSC weisen zudem besonders häufig differentielle Expression von Genen des WNT- und BMP-Signalweges auf, die beide essentiell für die Osteoblastogenese sind (siehe 6.2.1.2). Das Gen für LRP5 ist in beiden Systemen geringer exprimiert. LRP5 wird als einer der Schlüsselfaktoren für die Entstehung von Osteoporose beschrieben (Richards et al. 2009). Eine verringerte Expression lässt somit auf reduzierte Knochenformation schließen. Des Weiteren ist die Genexpression von epigenetischen Modulatoren verändert. Humane hMSC aus älteren Patienten exprimieren die Histonacetylasen HDAC8 und 9, sowie ATRX – eine Helikase der SNF2-Superfamilie, die ähnlich wie HELLS in der DNA-Methylierung involviert ist – geringer (Sun and Arceci 2005; Haberland et al. 2009; Sugo et al. 2010). In seneszenten hMSC ist DNMT1 geringer exprimiert, und dies könnte zusammen mit der verringerten Expression von HELLS in diesen Zellen zu dem bereits beobachteten Phänomen des verringerten Methylierungsgrades aufgrund des Alters führen, was in vielen gealterten Geweben beobachtet werden konnte (Lopatina et al. 2002; Fraga et al. 2005; Sun and Arceci 2005; Gravina and Vijg 2010). 106

Diskussion

Die ermittelten Daten lassen darauf schließen, dass in-vitro-gealterte hMSC durchaus Gemeinsamkeiten zu in-vivo-gealterten hMSC aufweisen, zumindest hinsichtlich der Funktion der differentiell exprimierten Gene. In beiden Systemen ist der Zellzyklus gestört und es gibt auch in hMSC-alt Hinweise auf Seneszenz. Die Migration ist ebenfalls negativ beeinflusst, wenngleich auf unterschiedliche Art und Weise. Des Weiteren konnten in beiden hMSC-Gruppen Störungen im Differenzierungspotential sowie Änderung von epigenetischen Modulatoren detektiert werden.

6.4 Osteoporose Osteoporose ist durch eine erhöhte Resorption durch Osteoklasten und eine reduzierte Aktivität von Osteoblasten beschrieben (Jilka 2003; Pernow et al. 2006; Galic et al. 2010). (Boyle et al. 2003). In der vorliegenden Arbeit wurde das Genexpressionsmuster von hMSC aus Osteoporose-Patienten untersucht, um herauszufinden, ob die Defizite der Knochenformation bereits in den Stammzellen – den Vorläuferzellen der Osteoblasten – zu finden sind.

6.4.1

Das Transkriptom osteoporotischer hMSC ist verändert

Die Untersuchungen wurden mit Mikroarray-Analysen von hMSC-OP aus Osteoporose-Patienten und den Kontrollzellen hMSC-K durchgeführt. Da sich die Spender dieser beiden hMSC-Gruppen jedoch um ca. 28,6 Jahre unterscheiden, konnte keine Aussage über die Veränderungen des Transkriptoms allein aufgrund des Alters getroffen werden. Ein Vergleich der Daten mit den SAM-Ergebnissen zu hMSC-alt (siehe 6.2.1), deren Spender sich nur in ca. 4,45 Jahren von den Spendern der hMSC-OP unterscheiden, diente dazu, nur die durch Osteoporose bedingten Veränderungen zu detektieren. 6.4.1.1

Reproduzierbare Genexpressionsänderungen trotz Spendervariabilität

Die Mikroarray-Daten der hMSC-OP wurden nicht gleich direkt mit jenen der hMSC-alt mittels SAM verrechnet, unter der Annahme, dass sich im Alter auch andere Krankheiten häufen, die das Genexpressionsmuster und die Ergebnisse dieser SAM beeinflussen könnten. Gene, die z.B. bei Osteoarthrose – einer im Alter gehäuft auftretende Krankheit (Karkucak et al. 2010) – als auch bei Osteoporose in hMSC höher exprimiert wären, würden dann keine Genexpressionsänderung zeigen und somit aus der näheren Betrachtung herausfallen (Logar et al. 2007; Coleman et al. 2010). Daher wurde der Vergleich mit hMSC-K aus Spendern mittleren Alters gewählt, um dieses mögliche Phänomen zu umgehen. Ein Vergleich mit hMSC aus weitaus jüngeren Donoren (< 20 Jahre) wäre noch aussagekräftiger, konnte jedoch aufgrund der mangelnder Patientenverfügbarkeit nicht gewährleistet werden. Allein der Vergleich von hMSC-OP und hMSC-K erbrachte, dass 1574 Genprodukte in hMSC-OP höher und 1135 Genprodukte in diesen Zellen geringer exprimiert werden. Dies sind weitaus weniger als beim Vergleich der nicht-osteoporotischen hMSC-alt mit hMSC-K (siehe 6.2.1). Bei der Evaluierung der SAM-Ergebnisse mittels semi-quantitativer PCR konnten die Ergebnisse der Mikroarray-Analysen zu 63,63% anhand von 11 untersuchten Genen bestätigt werden (Tab. 11). Für die Evaluierung wurde RNA von 4 der 5 hMSC-OP aus den Mirkroarray-Hybridisierungen verwendet. Von der 5. hMSC-OP-Population (hMSC558) stand keine RNA mehr zur Verfügung. Als Kontrollgruppe dienten hMSC aus 9 verschiedenen Spendern, da auch hier keine RNA der in den MikroarrayAnalysen verwendeten hMSC-K-Populationen mehr vorhanden war. Die Heatmat zu den MikroarrayDaten zeigt bereits, dass in der Gruppe hMSC-K Spendervariabilitäten für Probesets der Gene TGFB1, 107

Diskussion VEGFA und WNTB5 auftraten (Abb. 20). Eine differentielle Expression für diese Gene konnte in der Evaluierung nicht nachgewiesen werden, was auf eine starke Heterogenität im Genexpressionsmuster der hMSC-K-Populationen allgemein schließen lässt. Das Alter der Spender für die 9 hMSC-KPopulationen betrug durchschnittlich 47 Jahre. Wie in Abschnitt 6.2.1 bereits beschrieben, ist dieses Alter zumindest bei Frauen sehr heterogen hinsichtlich des Einsetzens der Menopause und des damit zusammenhängenden Östrogenmangels, der den Alters-assoziierten Knochenverlust einleitet (Duque 2008; Langsetmo et al. 2010; Sahin et al. 2011). Beginnender Knochenverlust bei Spendern der hMSC-K könnte somit die Ergebnisse des Vergleiches hMSC-OP mit hMSC-K verwischen, und daher die biologische Evaluierung aufgrund der Verwendung neuer hMSC-Populationen erschweren.

6.4.1.2 Die Änderungen im Genexpressionsmuster sind different von Spendern gleichen Alters ohne Osteoporose 6.4.1.2.1

Wenig Gemeinsamkeiten zwischen in-vivo-gealterten hMSC und hMSC-OP

Die oben beschriebenen SAM-Daten (6.4.1.1) wurden mit den Daten aus der SAM zu hMSC-alt (6.2.1) verglichen, und es zeigte sich, dass trotz ähnlichem Alter der Spender, nur wenige Überlappungen im differentiellen Genexpressionsmuster von hMSC-alt und hMSC-OP auftratraten. Nur 96 Genprodukte sind in beiden hMSC-Gruppen höher eprimiert und 140 Genprodukte sind geringer exprimiert, und können somit als differentiell exprimiert aufgrund des Alters der Spender und nicht aufgrund der Osteoporose definiert werden (Abb. 21). Zu den höher exprimierten Genen in beiden Gruppen zählt unter anderem PDGFA. Dieser Wachstumsfaktor wurde als hemmend für die Osteogenese beschrieben, aber fördert die Zellproliferation (Tanaka and Liang 1995; Graham et al. 2009a). GOstat-Analysen zeigten, dass weitere überlappend in hMSC-OP und hMSC-alt höher exprimierte Gene überrepräsentativ häufig der GO-Gruppe Zellproliferation zuzuordnen sind (Tab. 12). Eine Einleitung von oxidativem Stress über RAS-Signalkaskaden ist jedoch für PDGF ebenfalls beschrieben worden (Eswarakumar et al. 2005; Ramos 2008). Interessanterweise konnten überexprimierte Gene auch der GO-Gruppe Neurogenese zugeordnet werden und lassen auf die Differenzierung der hMSC-OP in die neurogene Richtung schließen. Das Potential zur Bildung von neuronalen Zellen wurde für hMSC bereits beschrieben (Blondheim et al. 2006). Es stellt sich jedoch die Frage, warum gealterte hMSC diese Richtung zu präferieren scheinen. In anderen Stammzellen wurde gezeigt, dass der Verlust der Selbstregeneration aufgrund von Alterung, oxidativem Stress oder DNA-Schäden zu einer prämaturen Reifung führen kann, oft sogar in weniger offensichtliche Richtungen. Zum Beispiel können gealterte, hämatopoetische Stammzellen in die myeloide Richtung differenzieren und Stammzellen der Muskeln in die fibrogene Richtung (Choi and Artandi 2009). Dass hMSC-OP und hMSC-alt gemeinsam das Potential zur Bildung von Neuralzellen erhöhen, könnte somit eine prämature, ungerichtete Differenzierung darstellen. Das Gen MAB21L2 ist entsprechend Mikroarray-Daten nicht nur in hMSC-alt (max. FC = 2,71) (siehe auch 6.2.1.2), sondern auch in hMSC-OP höher exprimiert (max. FC = 14,43). Dieses Gen ist ein Beispiel dafür, dass nicht alle Gene, die in die gleiche Richtung in hMSC-alt und hMSC-OP differentiell exprimiert sind, dies zwangsläufig nur aufgrund des Alters tun. Die semi-quantitative Untersuchung der Expression von MAB21L2 bestätigte, dass das Gen in hMSC-alt aus älteren Personen zwar höher exprimiert wird, jedoch in osteoporotischen hMSC nochmals höher exprimiert als in hMSC-alt vorgefunden werden kann (Abb. 34). Somit stellt die erhöhte Genexpression von MAB21L2 vermutlich ein Phänomen dar, das mit reduzierter Knochenformation einher geht, die generell aufgrund des Alters zu beobachten ist, und in der Osteoporose nochmals stärker ausgeprägt ist (Bartl 2008; Duque 2008; Langsetmo et al. 2010). Da MAB21L2 als Inhibitor des BMP-Signalweges fungiert (Baldessari et al. 2004), und dieser Signalweg essentiell für die Knochenformation ist, stellt das Protein ein neues Kandidatengen des Alters- und/oder Osteoporose-bedingten Knochenverlustes dar und sollte in Zukunft in der Zellkultur und an transgenen Tiermodellen näher untersucht werden. 108

Diskussion Gene, die in hMSC-alt als auch hMSC-OP geringer exprimiert werden und gleichzeitig überrepräsentativ GO-Gruppen zugeordnet werden können, werden ebenfalls in hMSC-seneszenz geringer exprimiert und in Abschnitt 6.4.2 näher erklärt. 6.4.1.2.2

Funktionelle Störungen in hMSC bei Osteoporose

Nach Abzug der differentiell exprimierten Genprodukte aufgrund des Patientenalters, ergaben sich 995 geringer exprimierte und 1478 höher exprimierte Genprodukte ausschließlich aufgrund von Osteoporose in hMSC-OP. Wie oben bereits erwähnt, sind dies deutlich weniger Genprodukte als in hMSC-alt aus Personen vergleichbaren Alters ohne Osteoporose differentiell exprimiert werden. Es stellt sich daher die Frage ob die polygenetische Krankheit Osteoporose auf eine abzuschätzende Anzahl von Genen reduziert werden kann, während die hMSC aus älteren Personen ohne Osteoporose eine viel breitere Streuung des Genexpressionsmusters aufgrund von unbekannten Grund- oder Nebenerkrankungen aufweisen. Das in osteoporotischen hMSC auftretende Muster scheint eingrenzbar und distinkter zu sein. Eine Erhöhung der Stringenz bei der Betrachtung der SAM-Daten, wie z.B. bei der Rangliste für die Identifizierung von Osteoporosekandidaten (Tab. 18), würde diesen Pool an differentiell exprimierten Genen weiter eingrenzen und spezifizieren. GOstat-Analysen an diesen verbliebenen Genprodukten zeigten nur wenig überrepräsentierte, wenngleich aussagekräftige GO-Gruppen auf. Geringer exprimierte Gene lassen sich für Funktionen bei der Chromosomenkondensation und dem Kinetochor finden (Abb. 23). Fehlerhafte oder nicht kondensierte Chromosomen führen zu fehlerhafter Bindung der Kinetochore an die Spindelmikrotubuli und letztendlich zur Misssegregation der Chromosomen während der Mitose (Samoshkin et al. 2009). Gene für CENPE (centromere protein E, 312kDa), SMC2 (structural maintenance of chromosomes 2) und NSL1 (MIND kinetochore complex component, homolog) sind betroffen (Anhang Tab. 25) und werden als essentiell für die korrekte Chromosomentrennung beschrieben (Scharfenberger et al. 2003; Behlke-Steinert et al. 2009; Maia et al. 2010). Die Stabilität der Replikationsgabel ist ebenfalls essentiell, um die Anhäufung und Weitergabe von DNA-Schäden zu vermeiden (Ruzankina et al. 2008), die sich vor allem bei der Alterung anhäufen und zu Seneszenz oder Tumoren führen können (Campisi and d'Adda di Fagagna 2007). In hMSC-OP sind Gene, deren Proteine Funktionen beim Aufbau der Replikationsgabel und dem Replisom erfüllen, geringer exprimiert. In hMSC-OP gibt es Hinweise für gestörte Migration (Abb. 23). TIMP2 (TIMP metallopeptidase inhibitor 2) ist höher exprimiert, wodurch für die Zellwanderung wichtige Metalloproteinasen gehemmt werden könnten (Lee et al. 2011). Des Weiteren sind TLR3 und TLR4 geringer exprimiert in den osteoporotischen Stammzellen (Tomchuck et al. 2008; Zhou et al. 2011). Ebenso die Hyaluronsäure-vermittelte Migration könnte aufgrund der geringen Expression von HMMR auf Defizite hinweisen (Savani et al. 2001; Tolg et al. 2006). Chemoattraktantien bzw. deren Rezeptoren werden in osteoporotischen Stammzellen jedoch höher exprimiert, wie z.B. CYR61 (cysteine-rich, angiogenic inducer, 61) und S1PR1 (sphingosine-1phosphate receptor 1, EDG1) (Tab. 13, Anhang Tab. 26) (Schutze et al. 2007; Pederson et al. 2008; Ishii et al. 2009). Die erhöhte Expression des Rezeptors S1PR1 könnte auf eine autokrine Stimulation der Migration hindeuten. CYR61 könnte sich – übertragen auf eine in-vivo-Situation – autokrin als auch parakrin auf Nachbarzellen auswirken, wie z.B. Osteoklasten oder Osteoklastenvorläufer. Es konnten weitere Osteoklastogenese-fördernde Faktoren differentiell exprimiert in hMSC-OP ge-funden werden. CSF1 wird auf mRNA-Ebene in hMSC-OP höher exprimiert, ebenso die Prostaglandin-synthetisierende Synthase PTGS2. Wenn die erhöhte Expression dieser Synthase letztendlich zu einer erhöhten Prostaglandin Synthese und Sekretion führen sollte, könnte dies zusammen mit der erhöhten Expression von ANGPTL4 (angiopoietin-like 4) die Osteoklastogenese stimulieren (Anhang Tab. 26, Tab. 13) (Sims and Gooi 2008; Graham et al. 2009b; Knowles et al. 2010). Des Weiteren wird der Rezeptor PTHR1 höher exprimiert. Es ist bekannt, dass kontinuierliche Gaben von PTH oder

109

Diskussion PTHLH, somit also auch die kontinuierliche Aktivierung des Rezeptors zu erhöhter Knochenresorption führt (Sims and Gooi 2008; Datta and Abou-Samra 2009). Gene, die mit Angiogenese assoziiert werden, sind in hMSC-OP ebenfalls höher exprimiert (ANGPTL4, VEGFB, BTG1). Es wurde bereits gezeigt, dass hMSC in-vitro in die endotheliale Richtung differenzieren können (Chung et al. 2009). Möglicherweise stellt diese Art der Differenzierung, wie die oben beschriebene Tendenz zur Neurogenese in alten hMSC (siehe 6.4.1.2.1), einen weiteren Beweis für die fehlgerichtete Differenzierungskapazität und den Verlust der Stemness in hMSC-OP aufgrund von Seneszenzanzeichen dar (Choi and Artandi 2009). Des Weiteren sind viele Wachstumsfaktoren bzw. deren Rezeptoren neben PDGFA höher exprimiert: VEGFB, IGF2, IGF2R, FGFR1 und HBEGF (Tab. 13). Diese erhöhte, autokrine Stimulation könnte ebenfalls einen „Rescue“-Mechanismus der Zellen darstellen, um dem Proliferationsstopp zu entgehen. Da es Anzeichen von Seneszenz in hMSC-OP gibt (siehe 6.4.2) kann angenommen werden, dass die Wirkung der Mitogene auf refraktäre Zellen wirkungslos bleibt. Die erhöhte mitogene Stimulation von Nachbarzellen in-vivo wäre jedoch denkbar. Marker der Knochenformation sind, entsprechend dem noch multipotenten Status der MSC kaum differentiell exprimiert. Jedoch spricht die erhöhte Expression des WNT-Signalweg-Inhibitors SOST für eine Störung der Osteogenese, da das Protein Sclerostin die Differenzierung und Proliferation von Osteoblasten und MSC hemmt, sowie die Apoptose von Osteoblasten fördert (siehe 6.5.3) (ten Dijke et al. 2008; Galli et al. 2010). KREMEN1 ist ebenfalls höher exprimiert. An Mäusen konnte gezeigt werden, dass zumindest der gleichzeitige Knock-out von KREMEN1 und KREMEN2 zu einem erhöhten Knochenvolumen und erhöhter Knochenformationsrate führt, während umgekehrt KEMEN2transgene Tiere eine ausgeprägte Osteopenie und gestörte Knochenheilung aufweisen (unpublizierte Ergebnisse in Kooperation mit Dr. T. Schinke und Mitarb., Hamburg). Beide Proteine können somit ebenfalls die Knochenbildung negativ beeinflussen (Ellwanger et al. 2008). LRP5, das Gen des WNTRezeptors ist jedoch höher exprimiert, sollte aber seine Osteogenese-fördernde Wirkung verlieren, aufgrund der höher exprimierten Inhibitoren (Li et al. 2005b). LRP5 wird als eines der vielversprechensten Kandidaten der Osteoporose gehandelt, da loss-of-function-Muationen zu Knochenverlust führen (Liu et al. 2006b; Richards et al. 2009). Des Weiteren sind die Osteoblastenmarker COL1A1 und IBSP, sowie der Androgen-Rezeptor AR höher exprimiert. In Mikroarray-Analysen einer anderen Arbeitsgruppe zu Osteoblasten aus Osteoporose-Patienten konnte IBSP ebenfalls geringer exprimiert vorgefunden werden (Trost et al. 2010). COL1A1 hingegen wurde in der Literatur in osteoporotischen MSC geringer exprimiert beschrieben (Dalle Carbonare et al. 2009). Ein Transkriptions-hemmender Polymorphismus in AR wurde ebenfalls als Osteoporose-relevant beschrieben (Langdahl et al. 2003). Die vorliegenden Ergebnisse zur osteogenen Differenzierungsfähigkeit und dem WNT-Signalweg in hMSC-OP sind z.T kontrovers zu Literurbefunden. Analysen auf mRNA- und Proteinebene, sowie funktionelle Untersuchungen des WNT-Signalweges in hMSC sollten in der Zukunft näher Aufschluss über die zugrunde liegenden Mechanismen in osteoporotischen hMSC hinsichtlich ihrer Knochenbildenden Kapazität liefern.

6.4.2

hMSC-OP zeigen Anzeichen von Seneszenz

Der Vergleich der differentiellen Genexpressionsmuster in hMSC-OP und nicht-osteoporotischen, invitro-gealterten hMSC-seneszent erbrachte relativ viele Gemeinsamkeiten. 222 Genprodukte sind in beiden hMSC-Gruppen geringer exprimiert, 57 höher. Der Vergleich aller drei in dieser Arbeit durchgeführten SAM zeigte, dass davon 42 Genprodukte sowohl in hMSC-seneszent, als auch in hMSC-OP und hMSC-alt geringer exprimiert werden, und 7 Genprodukte in allen drei hMSC-Gruppen höher (Abb. 21). Diese Genprodukte stellen somit Seneszenz-assoziierte Gene dar, die vor allem auf Defizite in Mitose, Zellzyklus-Checkpoint, Mikrotubuli, Spindelaufbau und DNA-Reparatur schließen lassen (Tab. 12). Interessanterweise befinden sich unter den in allen drei hMSC-Gruppen bzw. in hMSC-seneszent und hMSC-OP überlappend differentiell exprimierten Genen, Kandidaten, die bei 110

Diskussion Mikroarray-Untersuchungen an osteoporotischen Osteoblasten in der Literatur ebenfalls geringer exprimiert vorlagen: HMMR, CCNB1, CCNB2, LMNB1, ANLN, CDC2 und TOP2A (Trost et al. 2010). FST (follistatin), ein Förderer der Knochenformation durch antagonisierende Wirkung zu Activin A ist eines der 7 Gene, die in hMSC-alt, hMSC-seneszent und hMSC-OP höher exprimiert werden (Eijken et al. 2007). Dieses Gen wurde auch in osteoporotischem Knochen differentiell exprimiert vorgefunden (Hopwood et al. 2009). IGFBP5 ist, wenngleich repräsentiert durch jeweils unterschiedliche Probesets, ebenfalls in hMSC-alt, hMSC-OP und hMSC-seneszent höher exprimiert. Die Überexpression von IGFBP5 führte in Mäusen zu reduzierter Osteoblastenfunktion und geringerer Knochendichte (Canalis 2009). Diese Übereinstimmungen mit Literaturbefunden untermauern erneut die Verlässlichkeit der in dieser Arbeit durchgeführten Mikroarray-Analysen und -Berechnungen, und tragen dazu bei, die Liste möglicher Kandidatengene für Osteoporose noch stärker einzugrenzen. Des Weiteren zeigt die überlappende Expression in hMSC-OP und hMSC-seneszent, dass es sich hierbei vermutlich um Gene handelt, die aufgrund der Seneszenz differentiell exprimiert werden. Osteoporotische MSC-OP weisen somit Seneszenz-Anzeichen auf, die die Funktion dieser Zellen einschränkt. Zusammenfassend deuten die vorliegenden Mikroarray-Daten zum Genexpressionsmuster von hMSC-OP aus Osteoporose-Patienten auf Defekte in Migration und Genom-Integrität, sowie Störungen im WNT-Signalweg und fehlgerichtete Differenzierung hin. Über das osteogene Differenzierungspotential der Zellen konnte mittels der Daten keine Aussage getroffen werden. Osteoporotische hMSC weisen jedoch Anzeichen von reduzierter Proliferation und Seneszenz auf und beeinflussen die Osteoklastogenese positiv, wodurch die Knochenresorption direkt über diese Stammzellen gefördert wird. Analysen an Knochengewebe oder Patientenseren erbrachten bereits viele Kandidatengene für die Osteoporose und in der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass von diesen eindeutigen Kandidaten bereits zwei in den knochenbildenden Stammzellen auffällig sind: SOST und CSF1 (Wei et al. 2006; Richards et al. 2009). Weitere putative Kandidaten der Osteoporose sind ebenfalls in hMSC-OP differentiell exprimiert: HMMR, FST, IGFBP5 u.a. (Canalis 2009; Hopwood et al. 2009; Trost et al. 2010). Damit ist gezeigt, dass Defizite in der Knochenformation bei Osteoporose bereits in den Grundbausteinen der Knochenbildung zu finden sind.

6.5 Mittels Mikroarray-Analysen ermittelte Kandidatengene

6.5.1

A-SAA – Mineralisierungsförderer und Marker für Stress 6.5.1.1

Erhöhte A-SAA-Expression: Seneszenz versus Krebs

Inflammation ist ein Begleiter der Gewebeheilung und der Regeneration, kann jedoch vorteilhafte als auch negative Effekte auf den Organismus ausüben. Die bei der proinflammatorischen Akute-PhaseReaktion sezernierten Botenstoffe leiten Wundheilungsprozesse und weitere inflammatorische Reaktionen ein (Baumann and Gauldie 1994). Chronische Inflammation hingegen wirkt sich negativ auf den Organismus aus, kann zu Autoimmun- und chronischen Inflammationskrankheiten, wie z.B. Rheumatoide Arthritis, führen (Ostan et al. 2008; van der Hilst et al. 2008), aber auch Tumorentwicklung (Dinarello 2006), sowie die Alterung des Organismus (Weiskopf et al. 2009) voran treiben. Mikroarray-Analysen zeigten, dass in seneszenten hMSC die Gene der Akute-Phase Serum Amyloide A Proteine (A-SAA) – SAA1 und SAA2 – bis zu 52fach höher exprimiert werden als in hMSC P1. Semiquantitative PCR-Analysen konnten dies bestätigen, oft wurde sogar eine exklusive Expression in der 111

Diskussion seneszenten Passage Px detektiert (Tab. 16). Jedoch ist die Expressionszunahme nicht so konsistent wie bei dem Seneszenz-Marker CDKN2A (Tab. 10), denn 3 von 12 hMSC-Populationen zeigen eine höhere A-SAA-Expression in P1 verglichen mit Px. Da die Stammzellen aus Hüftköpfen von Patienten entnommen wurden, die oft an Osteoarthrose litten, könnte die erhöhte Expression der A-SAA in frühen Kultivierungsphasen auf diese Erkrankung zurück zu führen sein. Ein Zusammenhang zwischen erhöhtem SAA-Serumlevel in Trauma-Patienten und bei oxidativem Stress – ein möglicher Grund für die Entstehung von Seneszenz – ist ebenfalls beschrieben (Rael et al. 2009). Es konnte zudem gezeigt werden, dass die Überexpression von SAA1 oder SAA2 in immortalisierten hMSC-TERT zu erhöhter Aktivität von SA-β-Gal – einem Seneszenzmarker – führt (Abb. 30), jedoch gleichzeitig die stark erhöhte Proliferation der Zellen bedingt (Abb. 29B). Eine Überexpression von A-SAA führt in diesen Zellen auch zu einer morphologischen Veränderung (Abb. 29 C). Sie weisen eine längliche, schmale Form auf, die besonders stark in, mit SAA2 stabil transfizierten Zellen auftritt. Dieser Unterschied zwischen SAA2-hMSC-TERT und SAA1-hMSC-TERT könnte auf der Expression von A-SAA beruhen, die in SAA2-hMSC-TERT weitaus höher ist als in SAA1-hMSC-TERT (Abb. 29A). Die erhöhte Proliferationsbereitschaft dieser immortalisierten Zellklone steht im Gegensatz zur abnehmenden Proliferationsgeschwindigkeit in primären hMSC während der in-vitro-Alterung. A-SAA ist als Biomarker für bestimmte Krebsarten bereits beschrieben und wurde im Serum von Krebspatienten erhöht vorgefunden (Cho et al. 2010). Aber auch das Tumorgewebe selbst exprimiert mehr A-SAA, wie in einem Vergleich von Endrometriumkarzinom mit gesunder Gebärmutterschleimhaut gezeigt wurde (Cocco et al. 2010). Da hMSC-TERT durch die Überexpression von Telomerase eine Gemeinsamkeit zu vielen Tumorarten aufweisen (Artandi and DePinho 2010), könnte die zusätzliche Überexpression von A-SAA zu einer weiteren Annäherung der Zelllinie an einen Krebszellcharakter darstellen, wie die erhöhte Proliferationsgeschwindigkeit dieser Zellen vermuten lässt. Alles in allem wurden in der vorliegenden Arbeit zwei gegensätzliche Funktionen von A-SAA in mesenchymalen Stammzellen aufgezeigt. Zum einen deutet die erhöhte Expression von A-SAA auf Stress und letztendlich auf Seneszenz hin, wie in in-vitro-gealterten, primären hMSC gezeigt werden konnte. Zum anderen begünstigt A-SAA jedoch möglicherweise auch die Tumorentwicklung, wenn zumindest eine von vielen krebsfördernden Bedingungen – wie z.B. aktivierte Telomerase – bereits vorliegt. Die Einführung von A-SAA als neuer Seneszenz-Marker wäre somit zu überdenken. 6.5.1.2

A-SAA fördert die Mineralisierung

Da in einigen anderen Arbeiten seneszente hMSC in ihrer Fähigkeit, osteogen zu differenzieren, als eingeschränkt beschrieben wurden (Vacanti et al. 2005), wurde in der vorliegenden Arbeit die Bedeutung der erhöhten A-SAA-Expression für diese Funktion untersucht. Es konnte bereits bestätigt werden, dass bei der osteogenen Differenzierung die Expression von SAA1 als auch SAA2 ansteigt (Kovacevic et al. 2008). Durch Zugabe von rekombinantem hSAA1 konnte die Mineralisierung während der osteogenen Differenzierung verstärkt werden (Abb. 28A-C). Die Expression von osteogenen Markern war zwischen den verscheiden hMSC-Populationen inkonsistent, da alle drei Populationen auch unterschiedlich stark mineralisierten. Eine verstärkte Mineralisierung durch rhSAA1-Stimulation in hMSC-TERT konnte nicht eindeutig nachgewiesen werden (Abb. 28 D). Dies könnte darauf zurück zu führen sein, dass hMSC-TERT im Vergleich zu hMSC nur 10 statt 21 Tage differenziert werden konnten, um eine Ablösung vom Untergrund zu vermeiden. Eine Überexpression von A-SAA in hMSC-TERT bestätigt jedoch das in primären hMSC zu beobachtende Phänomen der verstärkten Mineralisierung (Abb. 30A). Kürzlich veröffentlichte Arbeiten zeigen, dass TNFA und IL1 im osteogenen Differenzierungsmedium die Mineralisierung fördern, indem die ALP-Aktivität steigt und die COL1A1-Expression sinkt (Ding et al. 2009). Es ist ebenfalls bereits bekannt, dass TNFA die Mineralisierung über die Aktivierung des NFKB-Signalweges in osteogen differenzierenden hMSC fördert (Hess et al. 2009). Da TNFA und IL1 als Stimulatoren der A-SAA-Expression beschrieben sind (Kovacevic et al. 2008), und NFKB wiederum durch A-SAA aktiviert wird, beweisen die vorliegenden Ergebnisse, dass A-SAA das fehlende 112

Diskussion Bindeglied zwischen Zytokinen und NFKB, und der damit einher gehenden Steigerung der Mineralisierung darstellt. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die erhöhte A-SAA-Expression in seneszenten hMSC keinen Einfluss auf deren reduziertes osteogenes Differenzierungspotential hat, das nach Vacanti et al. (2005) aufgrund von Seneszenz abnimmt. Im Gegenteil fördern SAA1 und SAA2 die Mineralisierung. Dies könnte in der in-vivo-Situation die pathologische Entstehung von Osteophyten erklären, deren Anzahl mit dem Alter der Patienten zunimmt (Watanabe and Terazawa 2006). Die durch Alterung erhöhte Expression dieser Akute-Phase-Proteine unterstützt auch die Hypothese, dass sie bei der Entstehung von extra-skelettalen Kalzifizierungen – wie z.B. Artheriosklerose – beteiligt sein könnten (Hua et al. 2009), deren Risikofaktor ebenfalls das Alter darstellt. Als Nachweis dieser Hypothese könnte die stabile Transfektion von A-SAA in Endothelzellen dienen. Da A-SAA die Mineralisierung fördert, müssen demnach andere Faktoren und Umstände zum reduzierten, osteogenen Differenzierungspotential von seneszenten hMSC beitragen. 6.5.1.3

Stress stimuliert Expression von A-SAA und Metalloproteinasen

In allen Fällen, ob bei in-vitro-Alterung von primären hMSC oder nach Serum-Entzug in hMSC-TERT, wurde ein paralleles Expressionsmuster von SAA1 und SAA2 festgestellt. Selbst hMSC mit Überexpression von SAA1 exprimierten auch SAA2 höher und vice versa (Abb. 29A). Es konnte sogar gezeigt werden, dass das Einbringen von SAA1 bzw. SAA2 mittels Vektoren auch die Transkription des endogenen A-SAA anregt. Dies bestätigt die Annahme, dass SAA1 und SAA2 gekoppelt exprimiert werden (Steel and Whitehead 1994). Die Stimulation mit rekombinantem rhSAA1 förderte in 2 von 3 hMSC-Populationen ebenfalls die SAA1- bzw. SAA2-Expression (Abb. 28E). Dies lässt vermuten, dass A-SAA-Proteine – ob rekombinant oder endogen produziert – die A-SAA-Transkription stimulieren. Der zweitägige Serum-Entzug führt in den SAA-hMSC-TERT-Klonen zu einer noch stärkeren, morphologischen Veränderung, wie besonders deutlich an SAA2-hMSC-TERT zu beobachten ist (Abb. 29B). Da dieser Klon bereits von Beginn an mehr A-SAA exprimiert (Abb. 29A) und eine extrem veränderte Zellform aufweist, kann die Hypothese verfolgt werden, dass nicht der Serum-Entzug für die morphologische Veränderung verantwortlich ist, sondern die nochmals erhöhte SAA1- und SAA2Expression in diesen Zellen (Abb. 30D). Ein Unterschied in der SA-β-Gal-Aktivität konnte aufgrund von Stress nicht beobachtete werden, generell weisen die A-SAA-hMSC-TERT-Zellen deutlich mehr SA-β-Gal-positive Zellen auf als die Kontrollzellen, wie bereits oben beschrieben. Durch den Serum-Entzug wird die Expression beider Akute-Phase-Gene in den hMSC-TERT nicht angeregt, und in den Kontrollzellen pcDNA-hMSC-TERT nur schwach. SAA1-hMSC-TERT und SAA2hMSC-TERT weisen die stärkste Expressionsänderung auf. Durch diese Form von Stress steigt in den Klonen auch die Expression der Metalloproteinasen MMP1 und MMP3. Dieser Rückkopplungseffekt könnte zur Amyloidbildung auf den Zellen führen, indem die Proteinasen A-SAA degradieren und sich dadurch Amyloid-A-Plaques bilden (Stix et al. 2001). MMP1 kann ebenfalls Knorpeldegradation bedingen, und führt auf diesem Weg über A-SAA letztendlich zur Entwicklung von Osteoarthiritis (Vallon et al. 2001). Interessanterweise ist auch die Expression des, als Seneszenzmarker geführten Gens PSG5 aufgrund von Serum-Entzug in den A-SAA-hMSC-TERT erhöht. PSG sind Proteine, die u.a. im embryonalen Teil der Plazenta gebildet werden und nach Fusion mit dem mütterlichen Plazenta-Epithelium an das Blutserum der Mutter abgegeben werden (Rawn and Cross 2008). Somit werden sie nicht nur in der Seneszenz (siehe 6.3.2), sondern auch in Stammzellen exprimiert. Das Expressionsmuster der PSG scheint einen Bogen zu vollführen, mit einer hohen Expression bei Stemness, einer abnehmenden Expression bei Stemnessverlust und einer erneut zunehmenden Expression aufgrund von Seneszenz. Somit beschreibt die hohe PSG5-Expression in den Kontrollzellen pcDNA-hMSC-TERT, dass die Zellen Stammzellcharakter aufweisen. Die A-SAA-hMSC-TERT-Klone zeigen bereits eine geringere PSG5Expression, die nach Serum-Entzug, vermutlich aufgrund der dadurch nochmals erhöhten A-SAAExpression in diesen Zellen, vollständig reprimiert wird. Die Überexpression von A-SAA in immortali-

113

Diskussion sierten hMSC-TERT beeinflusst somit höchstwahrscheinlich den Stammzellcharakter der Zelllinie negativ. Alles in allem, zeigt der Serum-Entzug, dass die A-SAA-Expression durch Stress angeregt werden kann, zumindest in Zellen, die bereits ein Grundexpressionslevel der Gene aufweisen. Je höher die ASAA-Expression ist, desto größer ist auch das Risiko zur Entstehung von Amyloid A-Plaques aufgrund von erhöhter MMP-Expression, und desto größer der Verlust des Stammzellcharakters. Dies ist ein weiteres Indiz dafür, dass die erhöhte Expression von A-SAA während der in-vitro-Alterung aufgrund von Stress – möglicherweise oxidativem Stress – ausgelöst wird.

6.5.2

HELLS – Verlust der Genexpression als neuer Marker für Seneszenz

Modifikationen der DNA durch Methylierungs- oder Histonacetylierungsmechanismen sind verantwortlich für veränderte Replikationsmuster in Zellen. Epigenetische Muster werden jedoch nicht nur im Fötus festgelegt, sondern verändern sich auch im Laufe der Alterung eines Organismus (Fraga et al. 2005; Gravina and Vijg 2010). Helikasen der SNF-Superfamilie – wie z.B. ATRX oder HELLS – könnten dabei eine wesentliche Rolle spielen, da sie als Modulatoren der DNA-Methylierung fungieren (Sun and Arceci 2005). Während der in-vitro-Alterung von hMSC zeigte die Lymphoid-spezifische Helikase HELLS eine deutliche Abnahme der Expression auf mRNA-Ebene (Abb. 31). Jedoch beginnt diese Abnahme erst nach einer Erhöhung der Expression im 2. Abschnitt der Kultivierungszeit (P4-P6). Davor, in sehr frühen Passagen (P1-P3), ist die HELLS-Expression geringer. Auch Gene, deren Expression durch HELLS aufgrund der Rekrutierung von DNA-Methyltransferasen oder Histon-Deacetylasen reguliert wird – z.B. POU5F1 (Xi et al. 2009) und FAS (Thaler et al. 2010) – folgen diesem Muster der anfänglich geringen Expression in frühen Passagen, besonders ersichtlich in der schematischen Darstellung nach Einteilung der Passagenzahlen in 5 Abschnitte (Abb. 32). Eine mögliche Erklärung hierfür wäre, dass hMSC nach Isolation aus dem Knochenmark eine gewisse Zeit – demnach sogar Wochen – brauchen, um sich der in-vitro-Kultur anzupassen. Die fehlende Expression von CDKN2A in den frühen Passagen beweist, dass keine Seneszenz in diesen Zellen vorliegt, trotz geringfügig geringerer Expression des P16-Inhibitors BMI1. Dennoch scheint die Stemness betroffen zu sein, zu beobachten an der reduzierten Expression von POU5F1 (OCT4) in frühen Passagen. Die in einigen hMSC-Populationen zu beobachtende, positive SA-β-Gal-Färbung in P1 (Abb. 26C) könnte ebenfalls ein Anhaltspunkt für Kultivierungsstress in frühen Passagen sein. Nach der höchsten Expression im zweiten von fünf Abschnitten der in-vitro-Alterung nimmt die HELLS-Expression relativ kontinuierlich ab, und dieses Expressionsmuster entspricht dem der POU5F1-Expression. Eine direkte Kontrolle des Stemness-Gens durch HELLS-Interaktion – wie in murinen, embryonalen Stammzellen bereits beschrieben (Xi et al. 2009) – ist somit auch für hMSC anzunehmen und müsste in weiteren Experimenten noch überprüft werden. Des Weiteren wurde das Gen des Apoptose-Vermittlers FAS – einem Mitglied der TNF-Rezeptor Superfamilie – untersucht. Die Bedeutung von FAS wurde bereits an murinen Prä-Osteoblasten (MC3T3-E1) analysiert, und eine erhöhte Expression wurde in Zusammenhang mit dem Verlust des Zell-Oberflächen-Kontaktes beschrieben, der zu Anoikis führt (Thaler et al. 2010). In diesen Zellen konnte mit der Abnahme der FAS-Expression eine erhöhte HELLS- und DNMT1-Expression detektiert werden. Dies lässt auf die Regulation von FAS über Methylierung des Promoters schließen. Während der in-vitro-Alterung von hMSC zeigt FAS in der schematischen Zusammenfassung (Abb. 31) nur geringe Expressionsabnahme in Px. Jedoch führen Spendervariabilitäten zu diesem Ergebnis. Wenn die 5 untersuchten hMSC-Populationen einzeln betrachtet werden, zeigt sich, dass in 3 hMSCPopulationen FAS in Px mindestens 2-fach geringer exprimiert wird als in P1 oder einer anderen frühen Passage (hMSC 613, hMSC574, hMSC622). Es wurde bereits beschrieben, dass seneszente Zellen nicht in die Apoptose eintreten (Cristofalo et al. 2004; Muller 2009) und dieses Ergebnis weist darauf hin, dass auch hMSC während der in-vitro-Alterung mehr und mehr das Potential verlieren, in die Apoptose eintreten zu können. Abnahme der FAS-Expression wird jedoch auch im Zusammen114

Diskussion hang mit Tumoren und der Metastasierung beschrieben, da ohne FAS bei Ablösung der Zellen von der Extrazellulären Matrix keine Anoikis mehr eintritt, können Tumorzellen im Körper wandern und neue Gewebe infiltrieren (Nguyen et al. 2009). Die Abnahme der FAS-Expression während der invitro-Alterung von hMSC könnte somit auch ein weiteres Beispiel darstellen, dass Zellen im Alter zwischen Tumorentwicklung und Seneszenz schwanken (Campisi 2001), und zusätzliche Faktoren dazu beitragen müssen, dass die Zellen am Ende in die Seneszenz eintreten. Während die HELLS-Expression abnimmt, steigt die CDKN2A-Expression an, bis sie in Px das höchste Level erreicht. Die beiden Gene werden somit reziprok exprimiert. Ob HELLS den-Promoter des Gens CDKN2A direkt reguliert (Zhou et al. 2009), bleibt zu überprüfen. Eine weitere Möglichkeit wäre die Kontrolle von P16 auf Proteinebene durch den P16-Inhibitor BMI1. Die BMI1-Expression nimmt jedoch nur sehr geringfügig während der in-vitro-Alterung ab, es konnte nur in 2 von 5 hMSCSpendern eine fast 2fach verringerte Expression in Px verglichen mit der höchsten Expression der Passage P2-P4 festgestellt werden (hMSC613, hMSC622). Eine direkte Rolle bei der P16-Regulation – wie von Sun et al., 2004 beschrieben – kann daher nicht angenommen werden, müsste aber mittels Nachweis auf Protein-Ebene näher untersucht werden. Als zweiter Seneszenz-Marker wurde PSG5 gewählt, die Expression steigt sehr schnell sehr stark an, auch während hohe HELLS-Expression vorliegt. Ein Zusammenhang zwischen beiden Genen scheint nicht vorzuliegen (siehe auch 6.3.2). Immuncytochemische Untersuchungen zeigten, zumindest in hMSC-TERT, dass HELLS in den Zellkernen lokalisiert ist, dort jedoch in der Intensität zwischen einzelnen Zellen große Unterschiede zu erkennen sind (Abb. 33A, B). Die Helikase wurde bereits als eng mit dem perizentromeren Heterochromatin oder der nukleären Matrix assoziiert, beschrieben (Yan et al. 2003). Die Funktion des Proteins besteht vermutlich darin, das Heterochromatin durch Rekrutierung von DNMT1 und anderen DNA-Methyltransferasen aufrecht zu erhalten. Eine Co-Lokalisation mit DNMT1 und späten Replikations-Foki in der S-Phase des Zellzyklus, sowie eine ausschließliche Lokalisation im Zellkern wurden ebenfalls beschrieben. Die höchste HELLS-Expressionsrate wurde in Fibroblasten in der SPhase detektiert (Yan et al. 2003). Da die hMSC-TERT für die immuncytologische Untersuchung in unterschiedlichen Stadien des Zellzyklus fixiert wurden, ist die unterschiedliche HELLS-Dichte in den Zellkernen zu erklären. Während der Mitose wurde HELLS auch im Cytoplasma der Zellen lokalisiert, vermutlich aufgrund der Auflösung des Zellkerns. Jedoch konnte HELLS auch nach der vollständigen Trennung von Zellen noch im Cytoplasma lokalisiert werden (Abb. 33B). Die vermutlich in der Telophase befindlichen Zellen scheinen HELLS nach Neubildung des Kerns erst noch in den Kern rekrutieren zu müssen. Zusammengefasst ist die abnehmende HELLS-Expression ein Anzeichen von Seneszenz in hMSC, und geht mit reduzierter Expression von Stemnessmarkern und Apoptose-Vermittlern einher. Ob es hier Zusammenhänge mit der Knochenformation gibt, wie HELLS -/- Mäuse vermuten lassen (Sun et al. 2004), bleibt zu beweisen. Eigene laufende Arbeiten (in Kooperation mit der Gruppe von PD Dr. T. Schinke, Hamburg) versuchen dieser Frage mit einem Hells-transgenen Mausmodell unter Kontrolle eines Knochenspezifischen Promoters näher zu kommen.

6.5.3

SOST – ein Marker für Osteoporose in hMSC

Sclerostin als Inhibitor des WNT-, als auch des BMP-Signalweges (Krause et al. 2010) wurde bereits in Verbindung mit Osteoporose gebracht (Gaudio et al. 2010). Verschiedene SNP („single nucleotide polymorphism“) des SOST-Gens sind im Zusammenhang mit erhöhtem Frakturrisiko beschrieben worden (Richards et al. 2009). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass bereits die Stammzellen, aus denen letztendlich die Knochen-bildenden Osteoblasten differenzieren eine differentielle Expression von SOST aufweisen. Das Gen wird in hMSC-OP aus Osteoporose-Patienten höher exprimiert als in hMSC jüngerer Spender oder Spendern vergleichbaren Alters ohne Osteoporose-Anzeichen (Abb. 35). Auch 115

Diskussion die Mikroarray-Analysen ergaben eine 7,3fach höhere Expression von SOST in hMSC-OP. Somit liegt bei Osteoporose bereits ein Defekt auf grundlegender Ebene des Knochenumbaus vor. Bisher wurde angenommen, dass SOST ein Osteozyten-spezifisches Gen ist, dessen Expression aufgrund von fehlender mechanischer Belastung angeregt wird und dadurch die Knochenbildung negativ beeinflusst (Robling et al. 2006; Galli et al. 2010). Es stellt sich daher die Frage, ob hMSC-OP prämatur gereift sind, somit also ihren Stammzellcharakter verloren haben, oder ob z.B. ein Defekt der Mechanosensitivierung in den hMSC-OP grundgelegt ist. Ten Dijke et al. fassten 2008 zusammen, dass die Expression von SOST in Osteozyten und somit erhöhte Sclerostinspiegel zu einer Hemmung der Proliferation von mesenchymalen Stammzellen führen. Eine endogen erhöhte SOST-Expression in hMSC aus Osteoporose-Patienten könnte somit zu einer Autoinhibition der Proliferation dieser Zellen führen. Damit würde sich in-vivo die Anzahl an hMSC in den Stammzellnischen nicht mehr erneuern, wodurch sich die Bildung von Osteoblasten ebenfalls reduziert und letztendlich die Knochendichte abnimmt. Ein direkter, negativer Einfluss von Sclerostin auf die Osteoblastendifferenzierung, sowie ein positiver Einfluss auf die Apoptose von Präosteoblasten und Osteoblasten sind ebenfalls bereits beschrieben (ten Dijke et al. 2008). All diese Mechanismen könnten das Ungleichgewicht zwischen Knochenbildung und Knochenabbau bei Osteoporose erklären. Des Weiteren wurden jeweils 3 hMSC-Populationen aus Osteoporose-Patienten und Patienten ohne Osteoporose vergleichbaren Alters osteogen differenziert. Dabei zeigte sich jedoch, dass auch die hMSC aus Patienten ohne Osteoporose-Anzeichen (keine Wirbelbrüche, kein Schenkelhalsbruch) eine leichte bis starke SOST-Expression aufwiesen, während in einer hMSC-OP-Population keinerlei SOSTExpression detektierbar war (Abb. 36A). Ein Unterschied in der Mineralisierungsstärke konnte ebenfalls nicht festgestellt werden (Abb. 36B). Alle 6 hMSC-Populationen zeigten im Vergleich zur jeweiligen Differenzierungs-Kontrolle positive Alizarin Rot S-Färbung auf. Innerhalb einer Untersuchungsgruppe konnten jedoch auch sehr starke Schwankungen in der Mineralisationsstärke detektiert werden. Ein Zusammenhang zwischen der Höhe der SOST-Expression und der Mineralisierung scheint nicht gegeben, unabhängig davon, ob es sich um hMSC-OP oder hMSC-alt-Kontrollzellen handelte. Diese Ergebnisse bestätigen nicht die von Rodriguez et al. 1999 beschriebene, reduzierte Differenzierungskapazität von hMSC-OP. Stenderup et al. konnten 2001 ebenfalls keinen Unterschied in der osteogenen Differenzierungsfähigkeit zwischen hMSC aus Osteoporose-Patienten und nichtOsteoporose-Patienten vergleichbaren Alters feststellen. Für eine gefestigte Aussage müssten die Experimente jedoch nochmals wiederholt werden, um die Anzahl an untersuchten hMSCPopulationen zu erhöhen. Die SOST-Expression in den Kontrollzellen lässt sich eventuell auf unbekannte Grunderkrankungen der jeweiligen Spender zurückführen. Des Weiteren ist Knochenverlust auch eine Erscheinung des ganz normalen Alterns (Duque 2008), und die Grenze zwischen Osteoporose und altersbedingtem Knochenverlust ist umstritten und verwischt (Diez 2002; Bartl 2008). Zusammenfassend kann jedoch behauptet werden, dass SOST in hMSC aus Osteoporose-Patienten prämatur exprimiert wird, somit einen Osteoporose-Marker darstellt. Weitere Untersuchungen sollten Aufschluss darüber geben, welchen direkten Einfluss die erhöhte Genexpression auf die Entstehung von Osteoporose ausübt. Hierfür wären Mikroarray-Analysen von hMSC hilfreich, die mit Hilfe von lentiviraler Transduktion SOST überexprimieren. Eine SAM aus RNA dieser Zellen, sowie aus RNA von Leervektor-transduzierten hMSC-Kontrollzellen, könnte anschließend mit den MikroarrayErgebnissen zu hMSC-OP verglichen werden (siehe 5.1.5.2). In beiden Analysen differentiell exprimierte Gene, könnten Kandidaten darstellen, deren Expression direkt durch Sclerostin reguliert wird, wodurch das Osteoporose-bedingte Genexpressionsmuster weiter eingegrenzt werden könnte. Auch für die funktionelle Charakterisierung dieses Kandidatengens wird derzeit ein transgenes Mausmodell entwickelt, das SOST unter der Kontrolle eines frühen Osteoblasten-Promoters überexprimiert und damit eine prämature Sekretion in Mausmodellen simuliert.

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Diskussion

6.6 Zusammenfassung Diskussion In der vorliegenden Arbeit wurde ein in-vitro-Alterungs-Modell etabliert, um Seneszenz in hMSC anhand der Genexpressionsänderungen zu untersuchen. Es zeigte sich, dass hMSC in sehr frühen Passagen noch unter Kultivierungsstress leiden, an den sich die Zellen anpassen müssen. Im Verlauf der Passagierung weisen die Zellen jedoch bereits früh Anzeichen von Seneszenz auf, da sich mehr und mehr seneszente Zellen im heterogenen Zellrasen ansammeln. Mittels Mikroarray-Analysen an hMSC der letzten, seneszenten Passage konnte festgestellt werden, dass diese Zellen neben einem gestörten Zellzyklus auch Defizite in der Migration und der osteogenen Differenzierungskapazität aufweisen. Des Weiteren wurden neue Seneszenz-Markergene detektiert, u.a. PSG5, HELLS und POU5F1 (OCT4). Die Expression von Letzteren scheint von der Helikase HELLS direkt reguliert zu werden, da beide parallel während der in-vitro-Alterung in ihrer Expression abnehmen. Diese und bereits bekannte Seneszenzmarker können in Zukunft dazu dienen, hMSC nach Kultivierung noch sicherer auf Seneszenz hin zu untersuchen, bevor sie therapeutische Verwendung finden. Die in seneszenten Zellen deutlich höher exprimierten Gene der Akute-Phase-Proteine – SAA1 und SAA2 – scheinen weniger Seneszenz- als Stress-induzierte Markergene darzustellen. A-SAAExpression führt bei der osteogenen Differenzierung von hMSC zu verstärkter Mineralisierung und könnte übertragen auf eine in-vivo-Situation eventuell zu unspezifischen Verkalkungen führen, wie sie bei Osteophyten, verkalkender Sehnenentzündung oder Arteriosklerose in älteren Patienten auftreten. Die vorliegenden Analysen ergaben des Weiteren, dass in-vitro-gealterte hMSC weniger Gemeinsamkeiten mit in-vivo-gealterten hMSC im Genexpressionsmuster aufweisen als erwartet. Entweder waren die Patienten der in-vivo-gealterten hMSC biologisch noch nicht alt genug, um bereits replikative Seneszenz aufzuweisen, oder aber die in-vivo-Alterung führt nicht zwangsläufig zu seneszenten Zellen, da Alterung eines Organismus auf vielen miteinander verwobenen, und oft gegensätzlichen Ereignissen beruht, wie z.B. Proliferationsstopp oder unkontrollierte Proliferation im Falle von Tumorentwicklung. Es ist ebenfalls nicht auszuschließen, dass mit Verwendung von älteren Patienten, die vermutlich kaum Alters-assoziierte Krankheiten aufwiesen, eine ungünstige Vergleichsgruppe gewählt wurde. Alterung geht unter anderem mit der Akkumulation von Krankheiten, wie der Entstehung von Tumoren, Krankheiten des Nervensystems, Osteoporose und Arteriosklerose einher (Kuro-o 2001; Mimeault and Batra 2009; Sahin and Depinho 2010). Die Spender der in-vivogealterten hMSC litten höchstwahrscheinlich nur an Osteoarthrose, Osteoporose wurde bei ihnen sogar ausgeschlossen. Die typischen Alterungserscheinungen waren somit nicht gegeben. Es stellt sich daher die Frage, ob diese Gruppe an Personen überhaupt das wirkliche Altern repräsentiert, da sie anscheinend Kompensationsmechanismen entwickelt haben, die sie vor Alters-assoziierten Krankheiten schützen oder die Entwicklung zumindest verzögern. Osteoporose-Patienten leiden jedoch oft gleichzeitig an Arteriosklerose (Tremollieres and Ribot 2010) und könnten somit die geeignetere Versuchsgruppe darstellen, um in-vivo-Alterung mit in-vitro-Alterung hinsichtlich Gemeinsamkeiten zu vergleichen. Nichtsdestotrotz konnten einige Gemeinsamkeiten aufgedeckt werden, die auf Defizite in der Proliferation und Migration in in-vivo-gealterten hMSC schließen lassen. In wie weit die Krankheit Osteoporose hMSC direkt beeinflusst, wurde ebenfalls untersucht und mit den Daten zur in-vivo-Alterung verglichen, um die rein Alters-assoziierten Genexpressionsänderungen herausfiltern zu können. Es zeigte sich, dass Osteoporose zu einem weit distinkterem, differentiellen Genexpressionsmuster führt als in-vivo-Alterung an sich. Nur wenige Gene sind aufgrund des Patientenalters auffällig, alle anderen aufgrund der Osteoporose. Dazu gehörten u.a. CSF1, MAB21L2 und SOST. Letzteres ist das Gen für den Osteozyten-Marker Sclerostin, einem WNTSignalweg-Inhibitor. Die prämature Expression von SOST und die Überexpression des BMP-SignalwegInhibitors MAB21L2 in hMSC aus Osteoporose-Patienten deuten auf eine Autoinhibition der Stammzellen hinsichtlich Proliferation und osteogener Differenzierungskapazität hin. In hMSC-OP 117

Diskussion wurden des Weiteren Defizite in Migration, Zellzyklus und DNA-Integrität aufgedeckt. Zudem weisen andere differentielle Genexpressionsmuster auf eine verstärkte Rekrutierung und Differenzierung von Osteoklasten hin. Damit charakterisieren die Ergebnisse zwei herausragende Defekte für die Knochenregeneration bei Osteoporose, die für das Krankheitsbild plausible pathogenetische Mechanismen darstellen. Gemeinsamkeiten zu in-vitro-gealterten hMSC deuten auf Anzeichen von Seneszenz in diesen Zellen hin. Der Knochenverlust bei Osteoporose ist somit nicht allein bedingt durch erhöhte Resorption durch Osteoklasten, und Funktionsverlust von Osteoblasten. Bereits in den Grundelementen der Knochenbildung – den MSC – können Störungen gefunden werden, die auf eine reduzierte Regenerationskapazität und eine gestörte Knochenformation schließen lassen. Bei all diesen Untersuchungen sollte im Auge behalten werden, dass es sich in allen Fällen um invitro-Analysen handelte, aufgrund der Kurz- oder Langezeit-Kultivierung der Zellen vor den Genexpressionsanalysen. Die natürliche Umgebung in-vivo hat jedoch ebenfalls Einfluss auf die Zellen, wie z.B. das Milieu der heterogenen Stammzellnische und die von Nachbarzellen ausgeschütteten Botenstoffe. All diese Einflüsse können bei der Kultivierung der hMSC nicht nachgestellt werden. Dennoch geben die hier vorliegenden Daten erstmalige Einblicke in das durch Alter oder Krankheit veränderte Genexpressionsmuster von Stammzellen des Knochens, und können als Ausgangspunkt für weitere Analysen und Charakterisierungen herangezogen werden.

6.7 Ausblick Die vorliegende Arbeit resultierte in einer großen Anzahl möglicher neuer Kandidatengene für Seneszenz und Osteoporose, die in Zukunft näher untersucht werden sollen. HELLS wurde auf mRNA-Ebene als Kandidat für die Seneszenz in hMSC ausführlich bestätigt. RNAiExperimente und Überexpression des Gens in hMSC mittels viraler Transduktion und anschließender in-vitro-Alterung könnten Aufschluss darüber geben, ob die Helikase direkt für den Eintritt der Zellen in die Seneszenz entscheidend ist. Um die Bedeutung von HELLS für die Knochenformation zu untersuchen, werden im Moment in Kooperation mit PD Dr. T. Schinke in Hamburg Mausmodelle mit knochenspezifischer Überexpression des Gens hergestellt. Unter Betrachtung der Ergebnisse von Sun et al. 2004 wäre aufgrund der Überexpression eine erhöhte Knochendichte und -stabilität zu vermuten, jedoch könnte auch die Entstehung von Tumoren gefördert werden, da HELLS die Zellproliferation voran treibt. Es sind Mikroarray-Analysen von Osteoblasten bzw. Osteoblastenvorläufern aus diesen Tieren geplant, die verglichen mit dem Wildtyp, Auskunft über die durch HELLS regulierten Gene geben sollen. Hinsichtlich der in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zur Alterung bleibt zu erwähnen, dass die verwendeten hMSC-Populationen aus verschiedenen Subpopulationen bestanden. Dies konnte anhand der vereinzelt in einigen Zellen auftretenden, positiven SA-β-Gal-Färbung in frühen Passagen gezeigt werden. Für alle Mikroarray-Untersuchungen wurde demnach ein RNA-Gemisch aus Zellen in unterschiedlichen Stadien verwendet (abgesehen von hMSC-seneszent). Um noch genauere Aussagen über Alters-bedingte Genexpressionsänderungen treffen zu können, müssten daher vor der Verwendung der RNA alle hMSC mittels Seneszenz-Marker einer Fluoreszenz-assoziierten Zellsortierung unterzogen werden, um bereits seneszente Zellen von noch proliferierenden Zellen trennen zu können. Anhand der bisher vorliegenden Ergebnisse zur Seneszenz, wären zu diesem Zweck Transmembranproteine, wie das Seneszenz-spezifisch exprimierte CDH1 geeignet, sowie FGFR2 oder HMMR, deren Expression aufgrund von Seneszenz reprimiert wird. Für die Osteoporose ist in näherer Zukunft die weitere Analyse von Sclerostin geplant. In hMSC wird im Moment SOST mittels viraler Transduktion überexprimiert. Die RNA dieser hMSC aus fünf unabhängigen Ansätzen soll mittels Mikroarray-Hybridisierungen und dem Vergleich mit Leervektor transfizierten Kontrollzellen untersucht werden und Aufschluss über das durch Sclerostin regulierte Genexpressionsmuster liefern. Mittels des Vergleichs dieser Daten und den in dieser Arbeit 118

Diskussion gewonnen Daten zu osteoporotischen hMSC könnte der Pool an Genen, die möglicherweise eine Bedeutung für die Entstehung von Osteoporose haben, weiter eingegrenzt werden. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe um PD Dr. T. Schinke, Hamburg, ist die Generierung von Mausmodellen, die murines Sost mittels des Col1a1-Promotors knochenspezifisch überexprimieren, in Arbeit. Es ist zu erwarten, dass diese Tiere eine reduzierte Knochenformation aufweisen werden. Es sind Frakturheilungsstudien in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe um Prof. Dr. A. Ignatius, Ulm, geplant, um die Probleme der verzögerten Frakturheilung beim Osteoporose-Patienten nachzustellen und zu untersuchen. Auch MAB21L2 stellt einen vielversprechenden Kandidaten der Osteoporose dar. Für dieses Protein würden RNAi- und/oder Überexpressionsexperimente an hMSC mit anschließender Untersuchung des Transkriptoms ebenfalls in Frage kommen. Da es sich um einen BMP-Inhibitor handelt, könnte die Auswirkung des Proteins für die Osteogenese in-vitro an hMSC untersucht werden mittels Überexpression oder Gabe von rekombinantem MAB21L2. Die vorliegenden Untersuchungen lieferten einen großen Pool an vielversprechenden Kandidatengenen für Seneszenz bzw. Osteoporose, der generell als Grundlage für viele weitere Experimente dienen kann.

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139

Anhang

8 Anhang

8.1 Zusatzmaterial 8.1.1

SAM-Ergebnisse zur differentiellen Genexpression

Tab. 19 Differentiell exprimierte Genprodukte mit Relevanz im NOTCH-Signalweg aus der SAM zu hMSC-alt inklusive Hybridisierungssignale Gen Symbol SBNO2

Gen Name

strawberry notch homolog 2 delta/notch-like EGF repeat DNER containing IL6ST interleukin 6 signal transducer SBNO2 strawberry notch homolog 2 PSEN1 presenilin 1 NOTCH2 Notch homolog 2 (Drosophila) PSEN1 presenilin 1 IL6ST interleukin 6 signal transducer MAML3 mastermind-like 3 NCSTN nicastrin CREB regulated transcription CRTC1 coactivator 1 FOXC2 forkhead box C2 ADAM metallopeptidase domain ADAM10 10 MAML2 mastermind-like 2 NOTCH4 Notch homolog 4 RBM15 RNA binding motif protein 15 megakaryoblastic leukemia MKL1 (translocation) 1 NRG1 neuregulin 1 nuclear factor of kappa light NFKBIA polypeptide gene enhancer in Bcells inhibitor, alpha ADAM metallopeptidase domain ADAM10 10 RBM15 RNA binding motif protein 15 NOTCH2 Notch homolog 2 N-terminal like NL NRG1 neuregulin 1 PSEN1 presenilin 1 SEL1L sel-1 suppressor of lin-12-like NOTCH3 Notch homolog 3 anterior pharynx defective 1 APH1A homolog A TP63 tumor protein p63 NOTCH2 Notch homolog 2 N-terminal like NL RBM15 RNA binding motif protein 15 recombination signal binding RBPJ protein for immunoglobulin kappa J region MESP2 mesoderm posterior 2 homolog POFUT1 protein O-fucosyltransferase 1 MIB2 mindbomb homolog 2 amyloid beta (A4) precursor APP protein spen homolog, transcriptional SPEN regulator (Drosophila)

Probeset-ID

q (%)

Hybridisierungssignale hMSC-alt-Populationen 520 559 606 663

Hybridisierungssignale hMSC-K-Populationen 276 247 295 296 353

215760_s_at

0,111

0,0

119

109

763

482

533

641

979

226281_at

0,252

6,8

128

603

211

1535

2194

100

776

542

204864_s_at 204166_at 238816_at 210756_s_at 207782_s_at 212196_at 242794_at 208759_at

0,257 0,268 0,287 0,303 0,337 0,350 0,419 0,421

0,2 0,2 0,2 0,0 0,0 0,2 6,8 0,2

220 239 190 1974 584 1805 11 1270

169 193 128 2172 667 2573 143 1311

208 316 187 2227 723 2800 71 1628

305 213 95 2525 701 3574 96 1437

560 877 345 5591 1825 5377 219 3351

1389 1066 528 7367 1764 7954 98 3791

774 517 747 9548 2350 9560 121 2671

470 704 406 5689 1642 7626 412 3055

1193 1315 588 8541 2335 7830 110 3902

207159_x_at

0,453

1,7

247

268

212

525

506

363

301

549

214520_at

0,463

3,4

200

102

141

246

332

347

600

188

399

214895_s_at

0,479

2,0

1259

1093

1044

1689

1520

3668

3432

2361

2280

235106_at 205247_at 1555761_x_at

0,506 0,527 0,554

1,3 3,8 12,7

705 186 296

325 100 257

303 201 383

509 119 287

922 356 823

849 391 337

812 279 799

890 171 253

1077 237 544

212748_at

0,580

3,4

730

805

646

540

1128

1002

950

1096

1685

208241_at

0,600

52,1

618

490

588

272

1721

227

282

276

1594

201502_s_at

0,604

3,4

4810

3634

3762

2397

5208

5398

5979

6976

6669

202604_x_at

0,605

6,8

1529

1205

1418

2277

1642

3398

3017

2636

2592

1555760_a_at

0,608

1,7

1229

1140

1002

1041

1612

2005

1852

1503

2104

227067_x_at

0,633

33,6 2675 3045 3012 2929 3046 3359

1117 5

208230_s_at 226577_at 202064_s_at 203238_s_at

0,643 0,680 0,682 0,706

1554417_s_at 209863_s_at

2994

2440

29,0 6,8 15,9 24,5

409 1781 456 2809

416 1322 591 1053

784 1211 825 974

350 1284 657 1967

1035 2043 596 3407

444 1614 1167 2309

505 2223 885 2047

358 2450 728 1097

1470 1954 1261 3192

0,715

11,1

675

478

827

579

810

727

1006

850

1079

0,742

50,6

291

223

166

508

782

442

223

461

1611 8

1199 9

1541 7

2019 4

2104 2

16790

214722_at

0,755

24,5

2521 3

9903

3118 8

228455_at

0,766

31,5

240

104

182

199

163

184

215

410

212

229540_at

0,771

29,0

396

144

234

171

448

175

318

282

311

1556015_a_at 212349_at 228261_at

0,773 0,774 0,776

29,0 29,0 31,5

222 507 445

389 1067 334

358 751 425

332 829 228

575 874 559

276 1322 367

380 999 316

353 1273 393

520 628 669

211277_x_at

0,780

22,2 1099

450

387

288

850

535

571

791

816

1556059_s_at

0,803

33,6

796

787

955

1151

1009

799

778

1548

140

855

Anhang MIB1

mindbomb homolog 1 anterior pharynx defective 1 APH1B homolog B (C. elegans) hairy/enhancer-of-split related HEY1 with YRPW motif 1 RBM15 RNA binding motif protein 15 recombination signal binding RBPJ protein for immunoglobulin kappa J region HES7 hairy and enhancer of split 7 NRG1 neuregulin 1 DTX3 deltex homolog 3 (Drosophila) FOXC1 forkhead box C1 PSENEN presenilin enhancer 2 homolog PSEN1 presenilin 1 recombination signal binding RBPJ protein for immunoglobulin kappa J region ADAM metallopeptidase domain ADAM17 17 hairy/enhancer-of-split related HEYL with YRPW motif-like DTX4 deltex homolog 4 (Drosophila) PSEN2 presenilin 2 PSEN2 presenilin 2 NRG1 neuregulin 1 WDR12 WD repeat domain 12 JAG2 jagged 2 MIB1 mindbomb homolog 1 JAG1 jagged 1 (Alagille syndrome) MIB2 Mindbomb homolog 2 MIB1 mindbomb homolog 1 NOTCH2 Notch homolog 2 (Drosophila) spen homolog, transcriptional SPEN regulator (Drosophila) ADAM metallopeptidase domain ADAM17 17

224725_at

0,807

22,2 2229 2254 2326 3014 2453 3110 3455 3282

2916

221036_s_at

0,829

26,8 1007 1178

956

1051

1113

1333

1225

1131

1518

44783_s_at

0,863

57,7

218

132

177

213

163

322

1555762_s_at

0,889

41,3 1947 1604 1096 1520 2126 1576 1796 1647

1528

211974_x_at

0,890

49,0

2282 3

13775

224548_at 208231_at 235721_at 213260_at 218302_at 203460_s_at

0,894 0,903 0,927 0,958 0,969 0,990

41,3 255 226 101 249 219 246 234 198 56,9 263 173 391 147 342 136 124 126 60,6 924 931 1163 940 1563 1091 602 640 58,4 6430 3002 5637 4264 3286 2809 7124 8665 56,9 1880 1395 2525 2392 1595 2391 2671 1892 59,7 2901 3455 4020 3804 3216 3284 4070 3743

264 621 1440 3340 2020 3595

207785_s_at

0,997

60,1

1941 3

12252

205745_x_at

1,012

60,3 3423 2097 2075 2134 2397 2254 2509 2215

2648

226828_s_at

1,013

60,1

209

198

240

141

125

231

213

201

212611_at 211373_s_at 204262_s_at 206343_s_at 218512_at 32137_at 224720_at 209098_s_at 241541_at 224722_at 202445_s_at

1,018 1,024 1,045 1,078 1,097 1,098 1,106 1,184 1,187 1,192 1,206

50,6 54,7 50,6 56,9 45,3 41,3 45,3 47,1 38,8 41,3 33,6

237 340 515 1687 2208 310 4919 1211 382 792 1239

87 441 557 3543 3098 304 3709 556 272 995 1153

154 510 485 3553 2957 212 4713 508 515 980 845

159 550 629 953 3039 244 5508 1587 418 1709 869

57 325 525 3174 2124 467 3755 411 310 712 1042

329 691 560 2825 3973 154 4010 857 350 670 804

139 336 424 1277 1670 169 4994 1510 343 1249 931

146 403 359 930 2091 134 4051 856 365 1267 666

112 492 747 3082 3023 293 4494 444 302 797 814

201997_s_at

1,213

26,8 2950 2898 3031 3113 2930 2465 2023 2210

2730

205746_s_at

1,238

29,0

614

NOTCH2

Notch homolog 2 (Drosophila)

212377_s_at

1,242

24,5

MAML1 RBM15

mastermind-like 1 (Drosophila) RNA binding motif protein 15 anterior pharynx defective 1 homolog B (C. elegans) sel-1 suppressor of lin-12-like

202360_at 219286_s_at

APH1B SEL1L MAML2

mastermind-like 2 (Drosophila)

123

2173 0

1766 8

177

1377 1

1310 6

1567 5

1377 3

454

489

850

547

1,279 1,280

15,9 22,2

2839 6 3621 3761

2522 8 3570 3972

2290 0 3611 3230

2142 0 3470 3228

2062 1 2521 2990

1763 3 3235 2270

2245 6 2727 3167

1903 5 2754 3071

226358_at

1,290

19,8 1250

917

988

910

922

763

721

824

711

202062_s_at

1,361

26,8 2467 1089 1800 1590 1634 1046 1115

842

1745 3883

235457_at

1,362

26,8

1012 6 3641 7 3231 1

5226

5277

6576

4507

3778

5304

2645 8 2833 0

2589 8 3337 8

2224 2 2037 8

2192 1 2111 6

2660 9 2715 7

1973 1 2570 6

686

697

773

748

984

612

246

262

304

300 9312

interleukin 6 signal transducer

212195_at

1,375

14,3

218902_at

1,386

22,2 1367 1163 1014

202063_s_at

1,394

33,6

ADAM metallopeptidase domain ADAM17 17 anterior pharynx defective 1 APH1A homolog A (C. elegans) hairy/enhancer-of-split related HEY2 with YRPW motif 2 NRG1 neuregulin 1 IL6ST interleukin 6 signal transducer

272

175

515

486

188

1743 6 1062 6

1654 9

1572 3 1299 1

1447 9 1268 2

1429 4

8243

9913

1323 0

7804

6209

6736

18622

1,459

12,7

202061_s_at

1,462

15,9

7927

8586

213532_at

1,469

11,1 2961 2867 3312 2926 1818 1488 2433 2304

2225

237327_at

1,494

14,3

133

198

172

237

153

137

130

114

219743_at

1,510

29,0

212

305

228

262

166

158

206237_s_at 204863_s_at

1,513 1,606

26,8 1732 1487 2711 635 1674 11,1 2094 2498 2331 3227 1583

782 908

291 2352

2130 1312

8740

5790

1522

1345

jagged 1 (Alagille syndrome)

209099_x_at

1,643

15,9

IL6ST

interleukin 6 signal transducer anterior pharynx defective 1 homolog A (C. elegans) ---

211000_s_at

1,688

5,2

1739 0 1905

218389_s_at

1,690

3,8

211193_at

1,763

17,7

---

20212

200602_at

JAG1

APH1A

2707 2363

3265 3 3023 6

IL6ST

sel-1 suppressor of lin-12-like

18866

5567

15,9

SEL1L

1393 6

743

1,371

APP

8086

1638 4

706

202443_x_at

SEL1L

1313 3

1028 8

597

Notch homolog 2 (Drosophila)

NOTCH1

8759

2226 7

879

NOTCH2

Notch homolog 1, translocationassociated (Drosophila) sel-1 suppressor of lin-12-like amyloid beta (A4) precursor protein

9726

141

7276

5180

6783

1154

1086

545 1744 1307 3 1345

4483

3430

2199

2944

3150

2670

122

174

8627

8722

1794

2442

1727 2 2574

4889

4896

5192

224

131

Anhang

JAG1

jagged 1 (Alagille syndrome)

216268_s_at

2,002

11,1

1579 6

6528

6729

1478 3

3447

4857

1005 4

5520

3497

201996_s_at

2,249

4,5

3122

1780

2868

2009

1825

496

982

1195

939

224726_at 205382_s_at

2,292 2,592

2,8 6307 4900 6087 6368 2893 1098 3104 3058 21 957 474 10,0 1005 1247 1066 234 248

2754 12

214953_s_at

2,709

0,8

231183_s_at 218737_at

3,212 3,402

1,3 0,4

JAG1 SBNO1

spen homolog, transcriptional regulator (Drosophila) mindbomb homolog 1 complement factor D (adipsin) amyloid beta (A4) precursor protein Jagged 1 (Alagille syndrome) strawberry notch homolog 1

FOXC1

forkhead box C1

1553613_s_at

4,066

0,2

SEL1L

Sel-1 suppressor of lin-12-like

230265_at

4,545

0,0

SPEN MIB1 CFD APP

2746 1

2454 1

2254 0

1864 3

1540 930 1482 3 3150

907 1221

794 1742 1536 7 5004

2135 1359 1302 7 6183

8519 3279

5547

5645

7701

1306 2

11039

414 282

382 476

582 417

497 237

217 518

2001

3141

4426

4345

1994

1304

929

945

830

838

Angegeben sind die Genexpressionsänderungen (FC) beim Vergleich von hMSC-alt zu hMSC-K und die Falsch-Positiv-Rate (q) in Prozent. Die Hybridisierungssignale wurden zuvor normalisiert von PD Dr. L. Klein-Hitpass. Die Sequenz eines Probesets konnte noch keinem Gen zugeordnet werden (---).

Tab. 20 Überlappend, differentiell exprimierte Genprodukte aus den SAM von hMSC-alt, hMSC-seneszent und hMSC-OP Gen Symbol

-----------------------------------------------------------------------------------

Gen Name

Probeset-ID

-----------------------------------------------------------------------------------

1555929_s_at 1556416_s_at 214078_at 236277_at 1555854_at 235846_at 238563_at 1560661_x_at 241693_at 241696_at 221973_at 237216_at 224047_at 215387_x_at 240141_at 1556682_s_at 227995_at 243108_at 224107_at 242277_at 235609_at 228481_at 239170_at 242890_at 210717_at 239449_at 239515_at 234074_at 240544_at 230461_s_at 235207_at 242480_at 1556216_s_at 1558750_a_at 1557275_a_at 230733_at 232796_at 231034_s_at 239979_at 1556322_a_at 238875_at

142

hMSCseneszent q FC (%) 0,185 2,4 0,582 8,0 0,133 0,6 0,121 0,0 1,271 56,1 0,449 0,3 1,262 43,8 0,568 7,0 0,938 48,6 0,423 1,2 0,615 7,0 0,490 9,5 1,757 9,5 0,588 9,5 0,647 17,7 0,408 4,2 0,143 0,0 0,884 38,3 0,407 3,4 2,819 0,6 0,273 0,2 0,502 8,0 1,559 26,5 0,197 0,4 0,904 35,6 0,828 32,6 0,477 4,2 0,839 38,3 0,946 46,3 0,506 2,7 0,617 5,8 0,559 9,5 0,617 4,2 0,139 0,2 2,151 7,0 0,586 1,2 0,405 7,0 0,515 5,8 0,209 1,0 0,636 8,0 0,334 2,4

hMSC-alt FC 0,850 0,330 1,620 1,063 0,187 1,128 0,185 0,590 0,498 1,413 1,268 0,457 0,412 0,823 0,387 0,262 1,158 0,499 0,581 0,298 1,041 1,521 0,486 0,840 0,270 0,567 0,845 0,528 0,498 0,169 0,835 0,496 0,924 0,854 2,767 0,603 0,465 0,340 0,589 0,496 0,203

q (%) 49,0 0,4 17,7 54,7 1,5 41,3 0,4 9,0 5,2 19,8 36,2 4,5 3,8 47,1 2,8 0,4 38,8 3,8 10,0 0,4 57,7 38,8 2,3 31,5 0,8 5,2 31,5 5,2 5,2 0,0 36,2 5,2 47,1 29,0 1,7 6,1 5,2 0,2 9,0 6,8 0,4

hMSC-OP FC

q (%)

0,178 0,179 0,206 0,247 0,280 0,285 0,308 0,336 0,363 0,386 0,397 0,401 0,405 0,412 0,416 0,434 0,436 0,437 0,444 0,463 0,480 0,483 0,485 0,488 0,488 0,502 0,504 0,514 0,528 0,530 0,543 0,564 0,572 0,583 0,588 0,592 0,605 0,606 0,630 0,648 0,651

3,9 0,0 1,4 1,4 9,0 0,0 4,4 3,9 2,7 5,7 4,9 9,0 9,0 6,3 6,3 9,0 9,0 7,3 5,7 4,9 8,2 8,2 7,3 4,9 8,2 4,4 4,9 8,2 8,2 10,3 5,7 17,3 8,2 3,9 17,3 6,3 19,0 12,8 17,3 15,8 28,4

Anhang ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------ABHD3 ABI2 ABI2 ACADS ACADVL ACSL5 ADAM10 ADAM12 AGRN AGRN AHSA2 AIG1

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------abhydrolase domain containing 3 abl-interactor 2 abl-interactor 2 acyl-Coenzyme A dehydrogenase, C-2 to C-3 short chain acyl-Coenzyme A dehydrogenase, very long chain acyl-CoA synthetase long-chain family member 5 ADAM metallopeptidase domain 10 ADAM metallopeptidase domain 12 agrin agrin AHA1, activator of heat shock 90kDa protein ATPase homolog 2 (yeast) androgen-induced 1

143

229490_s_at 243315_at 233014_at 231274_s_at 236778_at 236882_at 231042_s_at 235589_s_at 230790_x_at 227897_at 242245_at 228030_at 240263_at 230088_at 239808_at 1556543_at 238932_at 242769_at 224037_at 244372_at 238363_at 232347_x_at 1563797_at 1569362_at 230074_s_at 212608_s_at 240397_x_at 239140_at 242717_at 228222_at 239329_at 225725_at 230130_at 233757_x_at 213705_at 228582_x_at 214001_x_at 228850_s_at 241724_x_at 213813_x_at 228639_at 237438_at 214848_at 242206_at 215182_x_at 225767_at 217363_x_at 1563283_at 1563302_at 1555970_at 236229_at 230862_at 1559066_at 1556520_at 244787_at 237386_at 213017_at 207268_x_at 211793_s_at 202366_at 200710_at 222592_s_at 202604_x_at 215613_at 212285_s_at 217419_x_at

0,079 0,385 0,424 0,517 0,574 0,439 2,006 0,600 1,734 0,648 1,743 0,347 0,378 0,482 0,425 0,663 0,549 0,552 2,722 0,321 0,457 0,593 0,663 0,494 0,649 1,750 0,166 1,610 0,651 0,626 1,611 1,868 0,381 0,909 1,433 3,412 1,376 0,432 1,555 2,590 1,659 1,744 1,874 0,305 0,987 0,464 1,807 1,468 1,926 0,576 0,955 2,263 2,404 1,766 4,823 2,102 0,233 0,628 0,616 0,654 0,504 0,448 1,527 0,565 0,510 0,516

0,0 2,4 4,8 3,4 5,8 2,7 4,2 3,4 7,0 9,5 1,6 0,0 7,0 7,0 2,7 7,0 7,0 8,0 0,5 4,2 9,5 4,8 8,0 4,2 8,0 2,4 1,0 8,0 5,8 7,0 5,8 1,0 1,6 38,3 13,2 0,4 8,0 1,6 9,5 7,0 5,8 1,6 23,2 7,0 54,1 0,6 8,0 41,2 3,4 5,8 48,6 3,4 1,4 7,0 0,5 4,2 0,0 2,7 1,6 5,8 0,9 7,0 17,7 5,8 2,0 3,4

0,136 0,493 0,492 0,193 0,264 0,543 1,907 0,254 1,824 0,315 1,755 0,157 0,389 0,523 0,524 0,628 0,567 0,253 1,841 0,189 0,350 0,630 0,551 0,567 0,360 1,911 0,467 2,072 0,576 0,453 1,677 1,873 0,365 1,646 2,694 2,004 3,575 1,929 1,974 2,732 1,511 1,453 2,132 2,409 1,949 1,835 1,057 2,195 0,713 2,036 1,751 — 0,831 1,914 2,099 2,572 0,716 0,628 0,550 0,623 0,516 0,435 0,605 0,741 0,424 0,380

0,0 4,5 5,2 0,0 0,3 9,0 6,1 0,0 6,8 0,2 2,3 0,0 6,8 6,1 6,8 7,9 9,0 0,5 6,8 0,4 3,4 5,2 3,4 9,0 1,3 1,7 5,2 6,8 3,8 0,5 6,8 5,2 1,1 7,9 0,6 5,2 0,0 6,1 4,5 1,5 12,7 12,7 3,4 6,1 3,4 7,9 56,9 9,0 15,9 3,8 9,0 — 45,3 6,8 6,8 4,5 29,0 6,1 1,1 4,5 1,1 5,2 6,8 24,5 1,3 1,0

0,662 0,667 0,704 0,715 0,724 0,763 0,792 0,799 0,801 0,802 0,846 0,852 0,856 0,881 0,885 0,919 0,962 0,975 — 1,006 1,064 1,065 1,080 1,081 1,090 1,099 1,112 1,116 1,190 1,223 1,239 1,358 1,478 1,539 1,570 1,645 1,646 1,685 1,722 1,751 1,804 1,872 1,898 1,914 1,921 1,981 2,009 2,139 2,180 2,199 2,200 2,806 2,880 3,070 — — 0,441 1,376 1,425 1,108 0,977 0,578 0,527 0,515 1,640 1,853

20,9 20,9 26,2 19,0 24,3 26,2 34,3 28,4 36,5 34,3 32,3 36,5 49,0 43,9 42,2 38,5 58,6 49,0 — 42,2 61,3 62,0 58,6 60,2 49,0 56,7 50,6 57,7 36,5 47,4 42,2 14,2 28,4 8,2 9,0 11,7 7,3 5,7 8,2 11,7 3,5 3,5 7,3 9,0 9,0 9,0 3,9 2,2 3,2 4,4 1,4 0,9 2,2 2,5 — — 7,3 20,9 14,2 50,6 56,7 19,0 6,3 9,0 12,8 3,5

226665_at

0,543

4,8

0,594

5,2

0,713

19,0

232810_at

0,521

2,7

0,550

5,2

1,239

42,2

Anhang AKR1C1 AKT1 ALDH1L1 AMOTL2 ANKRD10 ANKRD11 ANKRD36B ANLN ANP32E APBB1IP APOBEC3C ARF3 ARFRP1 ARHGAP5 ARHGDIB ARHGEF7 ARL6IP1 ARL6IP6 ARSB ASAP1 ASF1B ASPH ASPM ATAD2 ATG4C /// CTR9 ATOH8 ATP6V0E1 ATP8B3 ATRX ATXN3 AURKA AURKA AURKB B3GNTL1 BAALC BARD1 BAT1 BAT2D1 BBX BCL2L1 BGLAP BHLHE40 BIN1 BIRC5 BIRC5 BIRC5 BLVRA BMI1 BMP1 BNC2 BRCA2 BTBD7 BTG1 BTN3A2 BTN3A2 BUB1 C11orf82 C12orf48 C12orf69 C14orf106 C14orf106 C18orf54 C1orf112 C1orf135 C1orf198

Aldo-keto reductase family 1, member C1 v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1 aldehyde dehydrogenase 1 family, member L1 angiomotin like 2 Ankyrin repeat domain 10 ankyrin repeat domain 11 ankyrin repeat domain 36B anillin, actin binding protein acidic nuclear phosphoprotein 32 family, member E amyloid beta (A4) precursor protein-binding, family B, member 1 interacting protein apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3C ADP-ribosylation factor 3 ADP-ribosylation factor related protein 1 Rho GTPase activating protein 5 Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) beta Rho guanine nucleotide exchange factor (GEF) 7 ADP-ribosylation factor-like 6 interacting protein 1 ADP-ribosylation-like factor 6 interacting protein 6 arylsulfatase B ArfGAP with SH3 domain, ankyrin repeat and PH domain 1 ASF1 anti-silencing function 1 homolog B (S. cerevisiae) aspartate beta-hydroxylase asp (abnormal spindle) homolog, microcephaly associated ATPase family, AAA domain containing 2 ATG4 autophagy related 4 homolog C (S. cerevisiae) /// Ctr9, Paf1/RNA polymerase II complex component, homolog Atonal homolog 8 (Drosophila) ATPase, H+ transporting, lysosomal 9kDa, V0 subunit e1 ATPase, class I, type 8B, member 3 alpha thalassemia/mental retardation syndrome X-linked ataxin 3 aurora kinase A aurora kinase A aurora kinase B UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-Nacetylglucosaminyltransferase-like 1 brain and acute leukemia, cytoplasmic BRCA1 associated RING domain 1 HLA-B associated transcript 1 BAT2 domain containing 1 bobby sox homolog (Drosophila) BCL2-like 1 bone gamma-carboxyglutamate (gla) protein basic helix-loop-helix family, member e40 bridging integrator 1 baculoviral IAP repeat-containing 5 baculoviral IAP repeat-containing 5 baculoviral IAP repeat-containing 5 biliverdin reductase A BMI1 polycomb ring finger oncogene bone morphogenetic protein 1 basonuclin 2 breast cancer 2, early onset BTB (POZ) domain containing 7 B-cell translocation gene 1, anti-proliferative butyrophilin, subfamily 3, member A2 butyrophilin, subfamily 3, member A2 budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog (yeast) chromosome 11 open reading frame 82 chromosome 12 open reading frame 48 chromosome 12 open reading frame 69 chromosome 14 open reading frame 106 Chromosome 14 open reading frame 106 Chromosome 18 open reading frame 54 chromosome 1 open reading frame 112 chromosome 1 open reading frame 135 chromosome 1 open reading frame 198

144

1562102_at 207163_s_at 215798_at 203002_at 227260_at 234701_at 220940_at 1552619_a_at 208103_s_at

0,857 0,602 1,523 1,236 0,609 0,513 0,564 0,061 0,644

54,1 2,7 8,0 43,8 4,8 3,4 8,0 0,0 9,5

0,129 0,425 1,743 1,724 0,323 5,988 2,002 0,424 0,873

0,7 0,2 6,8 9,0 0,2 0,0 12,7 2,8 43,5

0,213 1,275 — 1,516 0,687 0,461 0,480 0,432 0,464

4,4 20,9 — 6,3 19,0 4,4 7,3 7,3 3,9

219994_at

2,616

1,4

0,285

1,0

2,268

1,9

209584_x_at

0,585

1,0

0,442

0,0

1,433

9,0

211622_s_at 203174_s_at 1552627_a_at 1555812_a_at 235412_at 211935_at 225711_at 232197_x_at 236533_at 218115_at 209135_at 219918_s_at 218782_s_at

0,639 0,330 1,913 0,421 0,364 0,585 0,612 1,876 1,166 0,215 2,194 0,111 0,503

9,5 0,7 1,4 9,5 2,7 0,5 2,0 4,2 43,8 0,5 2,7 0,0 2,0

0,337 0,474 1,691 0,387 0,456 0,758 1,056 3,079 2,131 0,514 1,872 0,726 0,858

0,5 1,3 7,9 4,5 6,1 17,7 50,6 1,7 3,8 6,1 5,2 14,3 33,6

0,975 0,724 1,272 0,860 1,530 0,578 0,598 0,491 2,024 1,019 1,330 0,458 0,560

62,0 19,0 43,9 45,7 36,5 4,4 6,3 6,3 4,9 62,0 20,9 4,4 6,3

228190_at

0,796

20,4

0,639

6,1

0,626

9,0

1558705_at 214149_s_at 1554704_at 211022_s_at 216657_at 208079_s_at 204092_s_at 209464_at

1,725 1,773 0,550 1,506 0,526 0,201 0,239 0,107

9,5 5,8 7,0 11,2 5,8 0,0 0,0 0,0

— 5,184 0,974 0,425 0,594 0,537 0,555 0,482

— 0,0 54,7 1,7 9,0 6,1 5,2 1,7

2,568 1,246 0,567 0,510 0,538 0,467 0,519 0,799

6,3 32,3 8,2 9,0 10,3 4,9 6,3 26,2

213589_s_at

0,159

0,0

0,520

2,0

0,565

9,0

222780_s_at 205345_at 200041_s_at 214052_x_at 213016_at 215037_s_at 206956_at 201169_s_at 210202_s_at 202094_at 202095_s_at 210334_x_at 203773_x_at 202265_at 205574_x_at 229942_at 208368_s_at 224943_at 200921_s_at 212613_at 209846_s_at 215509_s_at 228281_at 220060_s_at 237484_at 206500_s_at 241816_at 241733_at 220840_s_at 220011_at 223063_at

0,220 0,190 0,584 1,882 0,984 1,722 0,595 0,396 0,465 0,071 0,049 0,133 0,574 1,520 0,623 0,545 0,259 0,968 0,763 0,421 0,496 0,054 0,158 0,544 2,179 0,480 0,599 0,338 0,489 0,550 1,875

1,4 1,2 5,8 7,0 58,8 8,0 3,4 4,8 3,4 0,0 0,0 0,4 0,7 1,6 7,0 4,8 1,2 54,1 23,2 1,6 0,9 0,0 0,3 1,6 4,8 0,9 4,8 0,0 2,0 8,0 1,6

0,469 0,506 0,299 2,089 0,469 0,331 0,568 0,190 0,411 0,593 0,634 0,596 1,362 1,641 0,348 0,617 0,403 0,468 2,393 0,558 0,491 0,097 0,773 0,566 1,066 0,954 0,604 0,553 0,735 0,505 1,853

6,8 5,2 0,2 6,8 1,1 0,4 7,9 0,3 0,8 6,8 9,0 7,9 14,3 3,8 0,3 11,1 2,8 0,7 6,1 6,1 2,0 0,0 24,5 3,8 49,0 47,1 6,8 4,5 24,5 6,8 3,8

0,916 0,844 1,223 0,593 0,583 1,877 1,112 1,785 1,433 0,459 0,500 0,653 0,652 0,710 1,183 0,538 0,687 0,631 3,173 0,744 0,777 0,736 0,378 0,664 3,062 0,546 0,828 0,860 0,496 0,777 1,645

58,6 40,4 34,3 14,2 9,0 4,9 59,5 8,2 19,0 6,3 4,4 15,8 9,0 8,2 36,5 9,0 28,4 9,0 0,0 26,2 26,2 22,6 2,5 15,8 3,2 8,2 38,5 36,5 7,3 38,5 6,3

Anhang C1orf96 C20orf11 C20orf43 C20orf43 C20orf69 ///B2016 ///PCMTD 2 C4orf46 C4orf46 C5orf41 C6orf173 C6orf26 /// MSH5 C9orf45 C9orf95 CALD1 CALR CAPS CASC5 CASP6 CBL CBX5 CCDC13 CCNA2 CCNA2 CCNB1 CCNB1 CCNB2 CCNE2 CCNE2 CCNF CCNL2 CD164 CDC2 CDC2 CDC2 CDC6 CDC7 CDCA2 CDCA8 CDK2 CDKN1A CDKN3 CDKN3 CENPA CENPA CENPE CENPH CENPI CENPK CENPM CEP55 CEP70 CEP70 CEPT1 CES1 CHAF1B CHD2 CHEK1 CHI3L1 CHI3L1 CHMP4B CIT CIZ1 CKAP2 CKAP4 CKS1B CKS2

chromosome 1 open reading frame 96 chromosome 20 open reading frame 11 chromosome 20 open reading frame 43 chromosome 20 open reading frame 43

1553697_at 218448_at 234926_s_at 233842_x_at

0,350 0,905 1,193 1,350

0,3 32,6 32,6 8,0

0,360 1,596 0,550 0,629

2,8 5,2 1,1 2,8

0,961 1,553 0,601 0,620

55,6 8,2 4,4 3,9

chromosome 20 open reading frame 69 /// protein-Lisoaspartate (D-aspartate) O-methyltransferase domain containing 2

232953_at

0,630

8,0

0,257

0,3

0,884

38,5

chromosome 4 open reading frame 46 chromosome 4 open reading frame 46 chromosome 5 open reading frame 41 chromosome 6 open reading frame 173

238015_at 235088_at 238476_at 226936_at

0,535 0,486 1,935 0,270

1,4 0,6 2,4 0,0

0,528 0,581 1,843 0,757

3,8 6,1 2,3 22,2

0,437 0,654 0,958 0,619

5,7 15,8 50,6 9,0

chromosome 6 open reading frame 26 /// mutS homolog 5

210410_s_at

0,143

0,0

0,509

0,8

0,872

38,5

chromosome 9 open reading frame 45 chromosome 9 open reading frame 95 caldesmon 1 calreticulin calcyphosine cancer susceptibility candidate 5 caspase 6, apoptosis-related cysteine peptidase Cas-Br-M ecotropic retroviral transforming sequence chromobox homolog 5 (HP1 alpha homolog, Drosophila) coiled-coil domain containing 13 cyclin A2 cyclin A2 cyclin B1 cyclin B1 cyclin B2 cyclin E2 cyclin E2 cyclin F cyclin L2 CD164 molecule, sialomucin cell division cycle 2, G1 to S and G2 to M cell division cycle 2, G1 to S and G2 to M cell division cycle 2, G1 to S and G2 to M cell division cycle 6 homolog (S. cerevisiae) cell division cycle 7 homolog (S. cerevisiae) cell division cycle associated 2 cell division cycle associated 8 cyclin-dependent kinase 2 cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1) cyclin-dependent kinase inhibitor 3 cyclin-dependent kinase inhibitor 3 centromere protein A centromere protein A centromere protein E, 312kDa centromere protein H centromere protein I centromere protein K centromere protein M centrosomal protein 55kDa centrosomal protein 70kDa centrosomal protein 70kDa choline/ethanolamine phosphotransferase 1 carboxylesterase 1 chromatin assembly factor 1, subunit B (p60) Chromodomain helicase DNA binding protein 2 CHK1 checkpoint homolog (S. pombe) chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39) chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39) chromatin modifying protein 4B citron (rho-interacting, serine/threonine kinase 21) CDKN1A interacting zinc finger protein 1 cytoskeleton associated protein 2 cytoskeleton-associated protein 4 CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B CDC28 protein kinase regulatory subunit 2

223522_at 1562761_at 214880_x_at 212953_x_at 226424_at 228323_at 209790_s_at 229010_at 209715_at 1554023_s_at 213226_at 203418_at 214710_s_at 228729_at 202705_at 205034_at 211814_s_at 204826_at 221427_s_at 208653_s_at 203213_at 210559_s_at 203214_x_at 203967_at 204510_at 226661_at 221520_s_at 211804_s_at 202284_s_at 1555758_a_at 209714_s_at 204962_s_at 210821_x_at 205046_at 231772_x_at 214804_at 222848_at 218741_at 218542_at 219036_at 1554489_a_at 1561884_at 209616_s_at 204775_at 226830_x_at 205393_s_at 209395_at 209396_s_at 225119_at 212801_at 213977_s_at 218252_at 200999_s_at 201897_s_at 204170_s_at

1,559 0,413 1,617 — 0,829 0,088 0,614 0,628 0,513 1,517 0,268 0,152 0,111 0,088 0,050 0,108 0,224 0,123 0,664 0,653 0,050 0,077 0,112 0,146 0,253 0,664 0,065 0,524 1,717 0,155 0,135 0,135 0,239 0,199 0,287 0,432 0,205 0,037 0,080 0,424 0,387 0,930 0,258 0,664 1,751 0,269 1,190 1,444 1,861 0,307 0,563 0,475 0,633 0,412 0,246

2,7 4,8 4,2 — 29,6 0,0 1,2 23,2 1,4 7,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 3,4 0,0 4,8 8,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,7 15,3 0,0 2,7 1,4 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 0,0 1,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,3 43,8 4,2 4,8 9,5 0,0 54,1 57,9 9,5 0,0 4,8 0,2 4,2 0,0 0,0

1,091 0,450 1,845 2,261 1,866 0,878 0,779 0,460 1,091 0,944 0,908 0,481 0,681 0,868 0,612 0,767 0,250 0,550 0,530 0,429 0,611 0,613 0,584 0,854 1,071 0,453 0,576 0,373 0,977 0,646 0,643 0,775 0,571 1,051 0,650 0,495 0,664 0,564 0,595 0,929 0,483 0,514 3,472 0,538 1,875 0,512 0,146 0,090 2,056 0,395 0,177 0,767 1,141 0,654 0,851

47,1 0,4 7,9 4,5 5,2 38,8 22,2 6,8 53,5 56,9 36,2 6,1 14,3 38,8 9,0 33,6 1,1 4,5 1,3 0,7 6,8 6,8 5,2 38,8 52,1 1,3 10,0 0,6 50,6 9,0 9,0 22,2 4,5 60,1 6,8 2,8 11,1 9,0 10,0 49,0 0,6 3,4 5,2 3,8 6,8 1,1 0,7 0,4 3,4 0,7 0,0 19,8 43,5 6,1 31,5

1,757 2,647 2,098 2,159 2,367 0,571 0,455 0,333 0,548 1,617 0,500 0,782 0,448 0,478 0,509 0,410 0,588 0,635 1,124 0,772 0,439 0,624 0,647 0,457 0,548 0,574 0,482 0,825 2,204 0,579 0,669 0,575 0,613 0,580 0,816 0,709 0,365 0,470 0,411 0,654 0,662 0,488 1,936 0,802 1,132 0,608 0,222 0,228 1,139 0,712 1,163 0,562 0,552 0,668 0,406

1,4 3,9 3,9 3,2 4,9 7,3 1,9 4,9 6,3 7,3 4,4 40,4 4,4 4,9 6,3 5,7 26,2 12,8 51,9 28,4 4,4 12,8 14,2 6,3 7,3 9,0 9,0 38,5 0,6 10,3 14,2 8,2 14,2 9,0 24,3 22,6 1,2 10,3 4,9 5,7 15,8 8,2 5,7 28,4 55,6 7,3 4,4 4,9 51,9 20,9 47,4 6,3 3,5 8,2 1,2

145

Anhang CLEC11A CLEC11A CLIP4 CLK4 CLN8 CLSTN1 CMPK2 CNTNAP3 CNTNAP3B CNTROB COL11A1 COL11A1 COL11A1 COL14A1 COL6A2 COL6A2 COLEC12 COMMD5 ///LOC100 287297 /// LOC10028 9699 COPS2 COX5B CPNE1 CPSF3L CR1 CRIM1 CRIP2 CSPP1 CUX1 CYP27C1 DARS DAXX DAZAP1 DCAF15 DCAF6 DCLK1 DDX11 DDX17 DDX54 DENR DEPDC1 DEPDC1 DHFR DIAPH3 DIO2 DKFZp686L 14188 DLEU2 /// DLEU2L DLG3 DLGAP5 DMPK DMWD DNALI1 DNLZ DOT1L DTL DTL DUT DUT E2F1 E2F5 EDEM3 EDNRA EFHD1 EFNB2 EIF5A

C-type lectin domain family 11, member A C-type lectin domain family 11, member A CAP-GLY domain containing linker protein family, member 4 CDC-like kinase 4 ceroid-lipofuscinosis, neuronal 8 calsyntenin 1 cytidine monophosphate kinase 2, mitochondrial contactin associated protein-like 3 contactin associated protein-like 3B centrobin, centrosomal BRCA2 interacting protein collagen, type XI, alpha 1 collagen, type XI, alpha 1 collagen, type XI, alpha 1 collagen, type XIV, alpha 1 collagen, type VI, alpha 2 collagen, type VI, alpha 2 collectin sub-family member 12

205131_x_at 210783_x_at 226425_at 1568836_at 219341_at 201561_s_at 226702_at 223796_at 244065_at 228633_s_at 229271_x_at 37892_at 204320_at 212865_s_at 213290_at 209156_s_at 221019_s_at

0,563 0,616 1,633 0,413 2,451 0,589 0,184 0,401 0,344 0,615 1,818 1,316 1,363 0,251 0,492 0,468 0,134

2,0 8,0 8,0 5,8 7,0 2,4 3,4 1,6 2,4 9,5 9,5 41,2 38,3 9,5 1,4 0,3 0,0

0,494 0,533 1,904 0,232 2,075 0,624 0,318 1,012 0,775 0,589 2,083 2,002 1,999 2,408 0,572 0,343 0,381

1,5 2,3 6,1 0,8 9,0 3,4 6,1 55,8 26,8 5,2 9,0 6,1 5,2 17,7 3,8 0,0 2,3

1,543 1,730 0,663 0,752 — 1,138 0,286 0,410 0,236 0,990 1,816 1,820 1,935 0,212 1,428 1,820 0,664

10,3 4,4 17,3 36,5 — 47,4 9,0 9,0 2,2 62,0 14,2 9,0 8,2 7,3 15,8 1,2 28,4

COMM domain containing 5 /// hypothetical protein LOC100287297 /// hypothetical protein LOC100289699

232640_at

1,809

9,5

0,396

2,8

2,155

3,5

COP9 constitutive photomorphogenic homolog subunit 2 Cytochrome c oxidase subunit Vb copine I cleavage and polyadenylation specific factor 3-like complement component (3b/4b) receptor 1 cysteine rich transmembrane BMP regulator 1 (chordin-like) cysteine-rich protein 2 centrosome and spindle pole associated protein 1 cut-like homeobox 1 cytochrome P450, family 27, subfamily C, polypeptide 1 aspartyl-tRNA synthetase death-domain associated protein DAZ associated protein 1 DDB1 and CUL4 associated factor 15 DDB1 and CUL4 associated factor 6 Doublecortin-like kinase 1 DEAD/H (Asp-Glu-Ala-Asp/His) box polypeptide 11 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 17 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 54 density-regulated protein DEP domain containing 1 DEP domain containing 1 dihydrofolate reductase diaphanous homolog 3 (Drosophila) deiodinase, iodothyronine, type II

209838_at 213736_at 206918_s_at 233625_x_at 217484_at 202552_s_at 208978_at 242041_at 214743_at 1568868_at 201624_at 216038_x_at 226620_x_at 221851_at 217908_s_at 229800_at 208149_x_at 213998_s_at 225428_s_at 238982_at 232278_s_at 235545_at 202534_x_at 232596_at 231240_at

1,723 2,122 0,646 0,625 — 1,515 0,297 0,430 1,677 0,595 0,533 0,561 0,487 0,360 1,661 0,548 0,391 0,339 0,620 0,456 0,033 0,090 0,473 0,559 0,506

0,3 3,4 4,2 4,2 — 8,0 1,4 2,4 1,6 8,0 4,2 2,7 0,0 2,4 1,0 7,0 1,6 5,8 4,8 5,8 0,0 0,0 0,0 7,0 4,2

1,602 2,025 0,422 0,632 2,030 1,668 0,298 0,520 1,939 1,402 1,906 0,617 1,094 0,175 1,540 2,018 0,517 0,357 0,564 1,045 0,332 0,708 1,452 0,304 0,229

5,2 4,5 0,2 6,8 7,9 9,0 1,0 9,0 6,1 17,7 6,1 6,1 50,6 0,2 6,8 9,0 1,3 7,9 3,8 52,1 0,7 12,7 36,2 0,4 0,2

0,891 — 1,103 1,325 2,770 0,986 0,744 0,900 1,401 0,404 1,875 0,727 0,602 1,527 0,892 0,495 1,199 0,267 1,437 0,402 0,529 0,598 0,466 0,285 1,026

36,5 — 53,2 19,0 1,6 57,7 42,2 30,2 11,7 6,3 3,5 20,9 4,9 12,8 38,5 7,3 45,7 4,9 19,0 7,3 12,8 9,0 4,4 2,5 60,2

hypothetical gene supported by BX538329

231412_at

0,650

9,5

1,960

7,9

1,789

3,5

215629_s_at

0,397

1,4

0,894

45,3

0,620

9,0

207732_s_at 203764_at 37996_s_at 213231_at 205186_at 228272_at 226201_at 218585_s_at 222680_s_at 208955_at 209932_s_at 2028_s_at 221586_s_at 220342_x_at 204463_s_at 209343_at 202669_s_at 213753_x_at

0,584 0,070 1,867 0,653 0,347 0,525 1,609 0,057 0,169 0,593 0,608 0,590 0,291 1,616 0,854 1,571 0,449 1,595

4,2 0,0 8,0 5,8 0,4 2,4 9,5 0,0 0,0 1,2 1,4 3,4 1,6 8,0 48,6 54,1 5,8 9,5

0,364 0,811 0,425 0,507 0,665 0,782 1,097 0,679 0,345 0,889 0,860 0,379 1,934 0,518 0,399 2,502 0,574 1,839

2,8 26,8 0,5 6,1 5,2 19,8 43,5 17,7 0,8 38,8 31,5 0,8 6,8 1,1 3,4 9,0 6,1 15,9

0,928 0,433 1,969 2,085 1,048 0,571 2,468 0,439 0,581 0,555 0,561 1,120 2,307 0,612 0,420 2,028 1,163 1,776

49,0 4,9 1,4 1,6 60,9 3,9 4,4 4,4 11,7 4,4 2,5 50,6 3,2 7,3 8,2 8,2 58,6 8,2

deleted in lymphocytic leukemia 2 (non-protein coding) /// deleted in lymphocytic leukemia 2-like discs, large homolog 3 (Drosophila) discs, large (Drosophila) homolog-associated protein 5 dystrophia myotonica-protein kinase dystrophia myotonica, WD repeat containing dynein, axonemal, light intermediate chain 1 DNL-type zinc finger DOT1-like, histone H3 methyltransferase (S. cerevisiae) denticleless homolog (Drosophila) denticleless homolog (Drosophila) deoxyuridine triphosphatase deoxyuridine triphosphatase E2F transcription factor 1 E2F transcription factor 5, p130-binding ER degradation enhancer, mannosidase alpha-like 3 endothelin receptor type A EF-hand domain family, member D1 ephrin-B2 eukaryotic translation initiation factor 5A

146

Anhang EMD EMILIN1 EML4 EPHA3 EPHA4 EPM2AIP1 EPOR EPOR ERAP1

emerin elastin microfibril interfacer 1 echinoderm microtubule associated protein like 4 EPH receptor A3 EPH receptor A4 EPM2A (laforin) interacting protein 1 erythropoietin receptor erythropoietin receptor endoplasmic reticulum aminopeptidase 1 excision repair cross-complementing rodent repair ERCC6L deficiency, complementation group 6-like ERMN ermin, ERM-like protein ETS2 v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 2 (avian) EZH2 enhancer of zeste homolog 2 (Drosophila) F2RL1 coagulation factor II (thrombin) receptor-like 1 FAM102B family with sequence similarity 102, member B FAM105B family with sequence similarity 105, member B FAM149B1 family with sequence similarity 149, member B1 FAM158A family with sequence similarity 158, member A FAM54A family with sequence similarity 54, member A FAM83D family with sequence similarity 83, member D FAM84B family with sequence similarity 84, member B FANCG Fanconi anemia, complementation group G FANCI Fanconi anemia, complementation group I FAR2 fatty acyl CoA reductase 2 FARP1 FERM, RhoGEF (ARHGEF) and pleckstrin domain protein 1 FBXO17 F-box protein 17 /// seryl-tRNA synthetase 2, mitochondrial /// SARS2 FBXO5 F-box protein 5 FBXO5 F-box protein 5 FBXO9 F-box protein 9 FEN1 flap structure-specific endonuclease 1 FEN1 flap structure-specific endonuclease 1 FGD1 FYVE, RhoGEF and PH domain containing 1 FGF1 fibroblast growth factor 1 (acidic) FGFR1OP2 FGFR1 oncogene partner 2 FHL1 four and a half LIM domains 1 FHL1 four and a half LIM domains 1 FHL1 four and a half LIM domains 1 FKBP7 FK506 binding protein 7 FOXM1 forkhead box M1 FRAS1 Fraser syndrome 1 FRMD5 FERM domain containing 5 FRMPD4 FERM and PDZ domain containing 4 FST follistatin FURIN furin (paired basic amino acid cleaving enzyme) FUS fusion (involved in t(12;16) in malignant liposarcoma) FUS /// fusion (involved in t(12;16) in malignant liposarcoma) /// NR1H3 nuclear receptor subfamily 1, group H, member 3 FUZ fuzzy homolog (Drosophila) FXYD5 FXYD domain containing ion transport regulator 5 G6PD glucose-6-phosphate dehydrogenase GADD45B growth arrest and DNA-damage-inducible, beta GALE UDP-galactose-4-epimerase UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide NGALNT2 acetylgalactosaminyltransferase 2 (GalNAc-T2) UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide NGALNT6 acetylgalactosaminyltransferase 6 (GalNAc-T6) GANAB glucosidase, alpha; neutral AB GCLC glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit GDAP2 ganglioside induced differentiation associated protein 2 GDF5 growth differentiation factor 5 GEMIN6 gem (nuclear organelle) associated protein 6 GFPT2 glutamine-fructose-6-phosphate transaminase 2 GGH gamma-glutamyl hydrolase GGT7 gamma-glutamyltransferase 7 GINS1 GINS complex subunit 1 (Psf1 homolog) GINS2 GINS complex subunit 2 (Psf2 homolog) GINS3 GINS complex subunit 3 (Psf3 homolog)

147

209477_at 204163_at 223069_s_at 206070_s_at 229374_at 227847_at 209963_s_at 209962_at 209701_at

1,046 0,505 0,605 0,574 1,653 1,018 0,507 0,338 1,742

56,6 1,0 1,0 9,5 9,5 58,8 5,8 4,2 2,4

2,145 0,647 0,364 1,528 0,686 0,575 0,582 0,302 1,845

1,3 7,9 0,2 14,3 11,1 3,4 9,0 1,0 6,1

1,708 1,292 0,960 0,246 1,851 0,615 1,197 2,543 1,338

3,9 26,2 51,9 7,3 4,4 8,2 43,9 2,2 38,5

219650_at

0,149

0,3

0,987

57,7

0,549

8,2

231911_at 201329_s_at 203358_s_at 213506_at 226568_at 240834_at 213896_x_at 219203_at 228069_at 225687_at 225864_at 203564_at 213007_at 220615_s_at 201911_s_at

0,400 1,078 0,254 0,102 0,455 0,605 0,573 0,548 0,281 0,124 1,050 0,426 0,368 0,668 0,648

9,5 54,1 0,0 0,3 0,4 9,5 1,0 2,7 0,0 0,0 38,3 0,0 0,0 26,5 5,8

0,323 0,343 0,989 1,395 1,279 0,809 0,651 0,637 0,739 0,627 2,649 0,492 0,861 0,436 0,518

7,9 1,0 56,9 41,3 26,8 41,3 4,5 7,9 24,5 12,7 6,1 0,5 33,6 6,1 1,3

0,516 0,434 0,591 0,177 0,624 0,269 0,711 0,849 0,448 0,461 2,107 0,705 0,361 0,423 1,119

28,4 7,3 9,0 2,2 9,0 2,7 15,8 38,5 5,7 9,0 3,9 14,2 4,4 9,0 51,9

—

3,255

1,7

4,360

0,6

218875_s_at 234863_x_at 1566509_s_at 204767_s_at 204768_s_at 204819_at 205117_at 243619_at 201539_s_at 210298_x_at 214505_s_at 223667_at 202580_x_at 226145_s_at 230831_at 239290_at 226847_at 201945_at 200959_at

0,280 0,341 1,560 0,361 0,425 0,585 0,643 0,537 1,557 1,643 1,272 0,564 0,045 — 0,646 4,441 1,859 0,581 0,575

0,0 0,0 2,4 0,5 0,3 1,6 9,5 2,7 58,8 58,3 54,1 4,8 0,0 — 29,6 0,0 9,5 4,8 2,7

0,978 0,528 1,608 1,038 0,557 0,574 0,591 1,083 0,332 0,453 0,378 0,306 0,577 2,678 0,378 1,631 2,055 0,509 1,387

49,0 1,7 7,9 59,1 6,1 1,5 6,1 49,0 0,8 3,8 1,5 0,2 11,1 2,8 6,1 33,6 6,8 3,8 36,2

0,405 0,608 0,733 0,493 0,827 1,024 0,891 0,540 0,467 0,473 0,487 0,918 0,397 3,073 0,459 1,982 2,011 1,591 0,527

2,2 10,3 17,3 8,2 36,5 62,0 45,7 6,3 5,7 7,3 8,2 47,4 6,3 1,4 9,0 5,7 3,9 26,2 7,3

1565717_s_at

0,762

32,6

0,455

2,8

0,522

9,0

221187_s_at 218084_x_at 202275_at 209304_x_at 202528_at

0,582 0,503 0,605 1,386 0,521

2,7 4,2 9,5 20,4 1,6

0,618 0,525 0,426 2,614 0,523

9,0 4,5 2,3 9,0 2,0

1,256 1,529 1,345 2,649 0,889

36,5 10,3 32,3 0,6 45,7

217788_s_at

1,016

58,8

0,556

0,7

0,558

4,4

219956_at

0,549

9,5

0,257

0,3

0,602

19,0

211934_x_at 202922_at 1554154_at 206614_at 219539_at 205100_at 203560_at 226469_s_at 206102_at 221521_s_at 45633_at

0,563 2,798 0,620 1,469 0,609 0,522 0,431 1,108 0,176 0,138 0,442

0,7 1,6 15,3 43,8 2,7 1,6 0,5 55,5 0,0 0,5 2,4

0,470 1,878 0,513 0,317 0,844 0,499 0,783 2,413 0,793 0,650 1,100

0,7 3,8 6,1 0,8 38,8 0,5 19,8 9,0 29,0 22,2 50,6

1,280 1,137 0,452 0,540 0,588 0,659 0,603 2,062 0,404 0,441 0,427

28,4 55,6 6,3 3,9 9,0 7,3 3,9 4,9 3,9 9,0 4,9

220233_at

Anhang GIYD1 /// GIYD2 GLI3 GLIPR1 GLIPR1 GLS GMDS GPC4 GPC4 GPI GPR172A GPR39 GPR85 GPSM2 GPSM2 GPX3 GPX3 GREM2 GRIA3 GSN GTPBP2 GTSE1 H2AFV HAPLN1 HAUS1 HDGF HECTD1 HECTD3 HELLS HELLS HELLS HHLA3 HJURP HMG20B HMMR HNMT HNRNPA2 B1 HNRNPA3 ///HNRNP A3P1 HNRNPA3 ///HNRNP A3P1 HNRNPD HNRNPM HNRNPR HNRNPU HOMER3 HOXA11AS HOXB2 HOXB3 HPCAL1 HSPB6 HSPB6 HTRA2 ICA1L ID4 ID4 IER5L IFI35 IFI44 IGF2BP2 IGF2BP2 IGFBP5 IGFBP5 IL1RAP

GIY-YIG domain containing 1 /// GIY-YIG domain containing 2 218317_x_at

0,649

3,4

0,643

6,1

0,912

49,0

GLI family zinc finger 3 GLI pathogenesis-related 1 GLI pathogenesis-related 1 glutaminase GDP-mannose 4,6-dehydratase glypican 4 glypican 4 glucose phosphate isomerase G protein-coupled receptor 172A G protein-coupled receptor 39 G protein-coupled receptor 85 G-protein signaling modulator 2 (AGS3-like, C. elegans) G-protein signaling modulator 2 (AGS3-like, C. elegans) glutathione peroxidase 3 (plasma) glutathione peroxidase 3 (plasma) gremlin 2, cysteine knot superfamily, homolog glutamate receptor, ionotrophic, AMPA 3 gelsolin (amyloidosis, Finnish type) GTP binding protein 2 G-2 and S-phase expressed 1 H2A histone family, member V hyaluronan and proteoglycan link protein 1 HAUS augmin-like complex, subunit 1 hepatoma-derived growth factor HECT domain containing 1 HECT domain containing 3 helicase, lymphoid-specific helicase, lymphoid-specific helicase, lymphoid-specific HERV-H LTR-associating 3 Holliday junction recognition protein high-mobility group 20B hyaluronan-mediated motility receptor (RHAMM) histamine N-methyltransferase

205201_at 204221_x_at 204222_s_at 221510_s_at 204875_s_at 204984_at 204983_s_at 208308_s_at 222155_s_at 229105_at 219898_at 205240_at 230002_at 201348_at 214091_s_at 220794_at 1569290_s_at 200696_s_at 223789_s_at 215942_s_at 212206_s_at 205524_s_at 225297_at 200896_x_at 241955_at 218632_at 220085_at 227350_at 223556_at 220387_s_at 218726_at 210719_s_at 207165_at 228772_at

0,788 0,603 0,659 2,115 0,456 1,681 1,429 0,577 0,646 2,027 0,872 0,204 0,241 0,474 0,598 1,357 2,917 1,387 0,502 0,096 0,949 1,033 0,553 0,598 2,273 0,478 0,186 0,275 0,308 0,660 0,144 0,643 0,032 0,447

26,5 8,0 5,8 1,2 1,2 15,3 32,6 5,8 5,8 4,2 58,8 0,0 0,4 2,4 8,0 35,6 0,4 8,0 8,0 0,0 46,3 52,6 1,4 1,6 0,5 1,0 0,5 0,0 1,0 8,0 0,0 4,2 0,0 4,2

1,665 0,827 0,980 2,393 0,424 2,761 2,376 0,557 0,574 0,569 2,178 0,373 0,251 0,300 0,328 0,372 1,091 1,613 0,092 0,562 0,648 0,519 0,738 0,637 3,356 0,406 0,706 0,965 0,965 0,437 0,501 0,594 0,795 1,232

9,0 26,8 53,5 1,5 1,3 0,8 3,8 6,8 3,8 6,8 6,1 0,5 0,4 0,4 0,4 1,7 60,1 6,1 0,0 6,1 7,9 6,1 12,7 6,8 0,0 0,4 15,9 36,2 50,6 0,4 3,8 3,4 22,2 33,6

1,692 0,361 0,593 1,465 1,290 1,850 2,182 1,240 1,765 0,424 2,276 0,516 0,648 0,849 1,173 0,375 1,659 1,900 1,086 0,710 0,562 0,414 0,666 0,948 1,165 1,312 0,231 0,324 0,529 1,622 0,848 1,550 0,450 0,406

4,4 3,9 8,2 9,0 36,5 7,3 2,7 38,5 8,2 5,7 3,9 8,2 24,3 34,3 47,4 6,3 6,3 0,6 55,6 20,9 4,4 7,3 9,0 51,9 42,2 17,3 1,4 4,9 8,2 9,0 34,3 4,9 3,9 7,3

heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1

205292_s_at

0,607

0,2

1,104

54,7

0,624

8,2

heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A3 /// heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A3 pseudogene 1

206809_s_at

0,598

4,8

0,567

9,0

0,433

4,4

heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A3 /// heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A3 pseudogene 1

211931_s_at

0,621

2,7

1,158

52,1

0,583

8,2

200073_s_at 200072_s_at 208765_s_at 216855_s_at 215489_x_at 230666_at 205453_at 228904_at 205462_s_at 214767_s_at 226304_at 211152_s_at 223881_at

0,619 0,637 0,521 0,608 0,656 0,735 0,475 0,423 0,398 3,083 3,112 0,642 1,652

0,4 2,7 0,6 5,8 8,0 20,4 4,2 5,8 1,0 5,8 8,0 8,0 8,0

1,253 0,841 0,597 0,100 0,612 1,622 0,496 0,767 0,333 0,244 0,432 0,503 0,752

38,8 33,6 4,5 0,0 6,8 7,9 1,5 33,6 0,3 0,4 5,2 2,3 26,8

0,517 0,493 0,421 1,097 0,958 1,816 0,717 0,376 1,770 2,426 3,865 1,037 1,996

3,9 4,4 2,5 61,7 58,6 7,3 20,9 6,3 3,5 1,6 0,0 60,5 8,2

209291_at

0,375

7,0

2,152

7,9

0,487

6,3

209292_at

0,319

7,0

2,156

6,1

0,518

9,0

226559_at 209417_s_at 214059_at 218847_at 223963_s_at 203424_s_at 203426_s_at 205227_at

0,833 0,532 0,278 0,873 1,750 8,688 2,936 0,862

20,4 5,8 0,9 41,2 9,5 1,0 4,8 29,6

1,581 0,449 0,510 3,076 0,807 6,826 0,926 0,632

6,1 3,4 7,9 0,7 45,3 1,5 55,8 7,9

1,874 0,595 0,518 2,570 3,641 — 2,404 0,524

4,4 15,8 14,2 0,9 0,6 — 2,7 6,3

heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D heterogeneous nuclear ribonucleoprotein M heterogeneous nuclear ribonucleoprotein R heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U homer homolog 3 (Drosophila) HOXA11 antisense RNA (non-protein coding) homeobox B2 homeobox B3 hippocalcin-like 1 heat shock protein, alpha-crystallin-related, B6 heat shock protein, alpha-crystallin-related, B6 HtrA serine peptidase 2 islet cell autoantigen 1,69kDa-like inhibitor of DNA binding 4, dominant negative helix-loophelix protein Inhibitor of DNA binding 4, dominant negative helix-loophelix protein immediate early response 5-like interferon-induced protein 35 Interferon-induced protein 44 insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2 insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2 insulin-like growth factor binding protein 5 insulin-like growth factor binding protein 5 interleukin 1 receptor accessory protein

148

Anhang IL1RAPL2 IL27RA IL6ST IPO9 IRF9 ITCH ITFG1 ITGA10 ITGA4 ITGA5 ITGB5 ITPR1 ITPR3 ITPRIPL2 JAK1 JAK2 JMY KAL1 KCNAB1 KCNAB1 KDM4C KIAA0101 KIAA0101 KIAA0415 KIAA1033 KIAA1033 KIAA1524 KIF14 KIF15 KIF18B KIF20A KIF22 KIF23 KIF23 KIF2C KIF2C KLHL24 KNTC1 KPNA2 KPNA6 KRAS KRTAP8-1 KY KYNU KYNU KYNU LASS6 LCAT LDB2 LGALS3BP LGALS8 LHFPL2 LHPP LMCD1 LMCD1 LMF2 LMNB1 LOC10012 8434 LOC10019 0939 LOC10028 7917 LOC10028 9169 /// NPIPL3

interleukin 1 receptor accessory protein-like 2 interleukin 27 receptor, alpha interleukin 6 signal transducer importin 9 interferon regulatory factor 9 itchy E3 ubiquitin protein ligase homolog (mouse) Integrin alpha FG-GAP repeat containing 1 integrin, alpha 10 integrin, alpha 4 integrin, alpha 5 (fibronectin receptor, alpha polypeptide) Integrin, beta 5 inositol 1,4,5-triphosphate receptor, type 1 inositol 1,4,5-triphosphate receptor, type 3 inositol 1,4,5-triphosphate receptor interacting protein-like 2 Janus kinase 1 Janus kinase 2 junction mediating and regulatory protein, p53 cofactor Kallmann syndrome 1 sequence potassium voltage-gated channel, shaker-related subfamily, beta member 1 potassium voltage-gated channel, shaker-related subfamily, beta member 1 lysine (K)-specific demethylase 4C KIAA0101 KIAA0101 KIAA0415 KIAA1033 KIAA1033 KIAA1524 kinesin family member 14 kinesin family member 15 kinesin family member 18B kinesin family member 20A kinesin family member 22 kinesin family member 23 Kinesin family member 23 kinesin family member 2C kinesin family member 2C kelch-like 24 (Drosophila) kinetochore associated 1 karyopherin alpha 2 (RAG cohort 1, importin alpha 1) karyopherin alpha 6 (importin alpha 7) v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog keratin associated protein 8-1 kyphoscoliosis peptidase kynureninase (L-kynurenine hydrolase) kynureninase (L-kynurenine hydrolase) kynureninase (L-kynurenine hydrolase) LAG1 homolog, ceramide synthase 6 lecithin-cholesterol acyltransferase LIM domain binding 2 lectin, galactoside-binding, soluble, 3 binding protein lectin, galactoside-binding, soluble, 8 lipoma HMGIC fusion partner-like 2 phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase LIM and cysteine-rich domains 1 LIM and cysteine-rich domains 1 lipase maturation factor 2 lamin B1

221112_at 222062_at 211000_s_at 244703_x_at 203882_at 209744_x_at 1556151_at 206766_at 205884_at 201389_at 214021_x_at 211323_s_at 201189_s_at 227954_at 1552611_a_at 205842_s_at 226352_at 205206_at

0,369 — 1,823 0,933 0,568 1,200 2,215 0,501 2,708 0,369 1,344 0,442 0,620 2,117 1,677 0,667 1,553 0,051

1,6 — 4,8 50,7 2,7 38,3 2,0 2,0 2,7 0,3 15,3 1,6 8,0 1,2 1,6 13,2 9,5 1,6

0,421 2,037 1,688 0,580 0,427 2,230 1,971 0,994 0,485 0,385 3,255 0,564 0,552 2,127 3,903 0,515 1,834 0,499

0,4 9,0 5,2 7,9 1,5 0,6 3,4 52,1 6,1 0,5 0,2 4,5 6,1 2,3 0,0 3,4 9,0 50,6

1,010 2,221 0,875 0,367 0,677 1,523 1,222 0,518 0,411 1,220 2,756 0,986 0,847 1,224 1,229 0,555 1,266 0,100

34,3 3,9 34,3 5,7 19,0 8,2 36,5 7,3 9,0 40,4 0,0 54,5 38,5 47,4 38,5 9,0 30,2 9,0

210471_s_at

1,171

58,8

0,330

3,8

0,249

4,4

210078_s_at

1,305

52,6

0,378

5,2

0,283

4,9

1556493_a_at 202503_s_at 211713_x_at 209913_x_at 215936_s_at 212794_s_at 231855_at 206364_at 219306_at 222039_at 218755_at 202183_s_at 204709_s_at 244427_at 209408_at 211519_s_at 221986_s_at 206316_s_at 201088_at 212103_at 214352_s_at 1564974_at 244572_at 204385_at 217388_s_at 210663_s_at 235463_s_at 204428_s_at 206481_s_at 200923_at 210732_s_at 212658_at

0,485 0,099 0,325 1,551 0,959 1,062 0,413 0,128 0,185 0,094 0,065 0,428 0,239 0,299 0,223 0,288 1,587 0,465 0,643 0,868 0,930 1,649 1,101 0,430 0,173 0,248 1,742 0,352 1,373 0,511 0,644 0,884

8,0 0,0 0,3 9,5 48,6 56,1 1,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,6 0,0 0,0 7,0 0,0 2,7 23,2 50,7 5,8 56,6 2,4 1,0 4,2 8,0 0,3 41,2 8,0 9,5 46,3

0,439 0,711 0,579 1,574 0,379 0,582 0,649 0,514 0,502 0,760 0,754 0,639 0,807 0,537 0,562 0,410 0,911 0,476 1,067 2,442 0,235 0,439 0,540 0,276 0,414 0,434 1,297 0,610 0,361 0,505 0,620 0,510

3,8 15,9 7,9 12,7 0,0 2,0 14,3 3,4 4,5 19,8 19,8 6,8 26,8 7,9 6,1 0,7 43,5 0,8 60,3 0,1 0,0 0,8 6,1 0,4 7,9 9,0 31,5 6,8 3,4 5,2 6,8 9,0

1,010 0,511 0,605 1,779 0,502 0,586 0,570 0,470 0,497 0,517 0,509 0,577 0,483 0,608 0,608 0,948 1,582 0,581 0,559 1,631 0,563 2,531 0,312 0,979 1,132 1,467 1,626 1,564 0,306 1,571 1,298 0,393

40,4 6,3 15,8 9,0 3,9 4,4 9,0 4,9 4,4 4,4 5,7 10,3 8,2 15,8 11,7 51,9 8,2 4,9 9,0 2,5 7,3 4,4 1,1 36,5 58,6 57,7 4,9 19,0 4,4 11,7 28,4 4,9

218523_at

0,547

2,4

0,567

3,8

1,637

5,7

218574_s_at 242767_at 31837_at 203276_at

1,573 4,741 0,645 0,127

4,2 1,2 4,2 0,0

1,102 2,098 0,578 2,173

55,8 26,8 2,8 10,0

1,617 2,782 1,537 0,521

4,9 3,9 5,7 6,3

Hypothetical protein LOC100128434

1561292_at

0,592

9,5

0,506

6,1

0,707

20,9

hypothetical LOC100190939

228913_at

1,802

8,0

1,882

4,5

0,843

36,5

hypothetical protein LOC100287917

226933_s_at

0,459

4,8

1,926

11,1

0,530

7,3

hypothetical protein LOC100289169 /// similar to acyl-CoA synthetase medium-chain family member 2 /// nuclear pore complex interacting protein-like 3

215921_at

0,297

1,2

0,268

1,5

1,392

20,9

149

Anhang LOC10028 9612 LOC10029 0661 LOC14977 3 LOC25845 LOC28366 3 LOC33865 3 LOC40023 6 LOC44043 4 LOC64316 7 /// RBM39 LOC72873 0 LOH12CR2 LPXN LRP5 LRRC16A LRRC8C LSM14B LTBP3 LTBP4 LXN LY6E MAB21L2 MAD2L1 MAD2L1 MAFG MAGED2 MAGI1 MALAT1 MAP2K2 MAP2K3 MAP2K7 MAP2K7 MAT2B MBNL1 MCM10 MCM2 MCM3 MCM4 MCM4 MCM5 MCM5 MCM8 MDC1 MDK MED13L MED16 MED27 MEF2A MEN1 MEOX2 METRN METTL3 MEX3D MFAP3L MFHAS1 MKI67 MKI67 MKI67 MLEC

arsenic transactivated protein 1

243840_at

0,411

1,2

0,700

15,9

0,491

8,2

hypothetical protein LOC100290661

1563077_at

1,714

5,8

1,007

54,7

2,326

3,5

Hypothetical protein LOC149773

1559433_at

0,474

0,5

1,033

56,9

0,527

4,4

hypothetical LOC25845

225458_at

0,664

9,5

0,553

3,4

1,054

54,5

hypothetical LOC283663

230245_s_at

0,481

5,8

0,627

7,9

0,945

34,3

hypothetical protein LOC338653

1562960_at

2,082

1,6

2,149

2,3

—

hypothetical LOC400236

227887_at

1,814

4,2

1,582

11,1

1,684

7,3

hypothetical protein FLJ11822

214107_x_at

0,580

1,6

0,383

0,2

0,653

14,2

similar to RNA binding motif protein 39 /// RNA binding motif protein 39

226404_at

0,454

0,0

2,662

2,8

1,701

3,5

Hypothetical LOC728730

242835_s_at

1,529

11,2

2,397

2,3

1,767

9,0

loss of heterozygosity, 12, chromosomal region 2 leupaxin low density lipoprotein receptor-related protein 5 leucine rich repeat containing 16A leucine rich repeat containing 8 family, member C LSM14B, SCD6 homolog B (S. cerevisiae) latent transforming growth factor beta binding protein 3 latent transforming growth factor beta binding protein 4 latexin lymphocyte antigen 6 complex, locus E mab-21-like 2 (C. elegans) MAD2 mitotic arrest deficient-like 1 (yeast) MAD2 mitotic arrest deficient-like 1 (yeast) v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog G melanoma antigen family D, 2 membrane associated guanylate kinase, WW and PDZ domain containing 1 metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1 mitogen-activated protein kinase kinase 2 mitogen-activated protein kinase kinase 3 mitogen-activated protein kinase kinase 7 mitogen-activated protein kinase kinase 7 methionine adenosyltransferase II, beta muscleblind-like (Drosophila) minichromosome maintenance complex component 10 minichromosome maintenance complex component 2 minichromosome maintenance complex component 3 minichromosome maintenance complex component 4 minichromosome maintenance complex component 4 minichromosome maintenance complex component 5 minichromosome maintenance complex component 5 minichromosome maintenance complex component 8 mediator of DNA-damage checkpoint 1 midkine (neurite growth-promoting factor 2) Mediator complex subunit 13-like mediator complex subunit 16 mediator complex subunit 27 myocyte enhancer factor 2A multiple endocrine neoplasia I mesenchyme homeobox 2 meteorin, glial cell differentiation regulator methyltransferase like 3 mex-3 homolog D (C. elegans) microfibrillar-associated protein 3-like malignant fibrous histiocytoma amplified sequence 1 antigen identified by monoclonal antibody Ki-67 antigen identified by monoclonal antibody Ki-67 antigen identified by monoclonal antibody Ki-67 malectin

236311_at 216250_s_at 209468_at 230793_at 1558517_s_at 219653_at 219922_s_at 204442_x_at 218729_at 202145_at 210302_s_at 203362_s_at 1554768_a_at

1,608 1,496 0,513 0,949 0,523 1,214 0,607 0,521 0,219 0,406 0,435 0,230 0,225

5,8 48,6 2,4 48,6 0,5 43,8 4,2 4,2 0,0 1,4 23,2 0,0 0,0

1,911 0,434 0,545 0,516 0,639 3,003 0,616 0,625 0,735 0,196 2,711 0,894 0,602

6,1 1,7 4,5 2,8 4,5 0,3 5,2 4,5 31,5 0,0 9,0 43,5 7,9

1,917 0,450 1,929 0,523 0,913 2,466 1,165 1,838 0,446 1,473 6,936 0,599 0,619

17,3 4,4 8,2 8,2 47,4 1,2 38,5 12,8 4,4 30,2 0,0 9,0 14,2

204970_s_at

1,028

55,5

3,568

0,4

1,965

2,5

208682_s_at

0,656

2,0

0,602

1,7

0,986

57,7

232859_s_at

2,823

0,0

2,917

0,3

1,546

32,3

227510_x_at 202424_at 207667_s_at 226023_at 209951_s_at 217993_s_at 1558111_at 220651_s_at 202107_s_at 201555_at 212142_at 222036_s_at 201755_at 216237_s_at 224320_s_at 203061_s_at 209035_at 216109_at 221545_x_at 221598_s_at 208328_s_at 202645_s_at 206201_s_at 232269_x_at 242111_at 91816_f_at 205442_at 225478_at 212022_s_at 212021_s_at 212020_s_at 200616_s_at

4,592 0,543 1,710 — 2,185 0,642 0,667 0,056 0,322 0,517 0,489 0,643 0,193 0,349 0,454 0,411 0,307 0,500 0,603 0,629 1,754 0,594 0,167 0,798 0,630 0,671 2,439 0,610 0,092 0,218 0,445 0,618

0,0 4,2 9,5 — 1,6 9,5 15,3 0,0 0,4 1,0 2,0 4,8 0,6 0,0 1,6 1,0 0,0 8,0 8,0 4,8 3,4 2,7 0,0 26,5 2,0 2,4 4,2 0,3 0,0 0,0 0,9 1,4

0,737 0,577 1,065 1,687 1,464 1,181 0,566 0,730 0,485 0,791 0,314 0,918 0,446 0,467 0,377 0,193 0,391 0,436 0,604 0,998 3,728 0,559 1,133 1,733 0,609 2,832 2,477 0,631 0,400 0,429 0,443 1,705

14,3 5,2 50,6 7,9 19,8 33,6 6,8 31,5 6,8 31,5 0,6 43,5 6,1 6,8 1,0 0,2 1,3 4,5 7,9 60,1 0,0 2,0 50,6 6,1 5,2 0,7 2,3 1,7 1,7 1,1 1,1 4,5

2,301 2,140 2,410 1,879 4,062 0,567 0,481 0,429 0,487 0,554 0,539 0,556 0,471 0,511 0,485 1,044 1,270 0,330 1,198 0,470 1,075 1,214 0,240 3,187 1,188 2,150 1,306 0,808 0,518 0,602 0,753 0,520

7,3 1,4 0,9 3,2 0,0 9,0 5,7 9,0 9,0 8,2 11,7 9,0 11,7 9,0 6,3 61,8 45,7 4,4 36,5 8,2 62,0 30,2 0,0 0,0 53,2 0,6 43,9 24,3 10,3 12,8 28,4 2,7

150

Anhang MLEC MMP11 MMP14 MMP14 MMP3 MNT MON1B MPHOSPH 9 MPI MRC2 MRPL33 MRPS5 MRTO4 MTSS1 MX1 MX2 MYADM MYL12A MYO1C NAALADL1 NASP NAT14 NAV1 NCAPD2 NCAPG NCAPG NCKAP1 NDC80 NDE1 NEAT1 NEAT1 NEIL3 NEK2 NEK9 NEXN NF1 NFIX NFYA NID1 NIPAL3 NIPSNAP1 NME4 NOL12 /// TRIOBP NONO NOTCH2 NRXN2 NSD1 NSUN3 NUDT1 NUDT21 NUF2 NUSAP1 NUSAP1 OAS1 OAS2 OAS2 OAS2 OAS3 OASL OASL OGFRL1 OIP5 OR2A20P /// OR2A5 ///

malectin matrix metallopeptidase 11 (stromelysin 3) matrix metallopeptidase 14 (membrane-inserted) matrix metallopeptidase 14 (membrane-inserted) matrix metallopeptidase 3 (stromelysin 1, progelatinase) MAX binding protein MON1 homolog B (yeast)

200617_at 203878_s_at 202828_s_at 160020_at 205828_at 204206_at 233557_s_at

0,546 — 1,121 1,230 0,135 1,035 1,534

1,2 — 58,8 54,1 9,5 54,1 8,0

0,399 1,967 2,202 1,995 0,140 1,739 0,853

0,2 6,1 2,8 7,9 4,5 9,0 41,3

0,897 2,502 1,926 2,163 0,510 1,558 1,570

45,7 5,7 8,2 1,4 56,7 9,0 8,2

M-phase phosphoprotein 9

221965_at

0,593

1,2

0,649

9,0

0,849

32,3

mannose phosphate isomerase mannose receptor, C type 2 mitochondrial ribosomal protein L33 mitochondrial ribosomal protein S5 mRNA turnover 4 homolog (S. cerevisiae) metastasis suppressor 1 myxovirus (influenza virus) resistance 1, interferon-inducible protein p78 (mouse) myxovirus (influenza virus) resistance 2 (mouse) myeloid-associated differentiation marker myosin, light chain 12A, regulatory, non-sarcomeric myosin IC N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase-like 1 nuclear autoantigenic sperm protein (histone-binding) N-acetyltransferase 14 (GCN5-related, putative) neuron navigator 1 non-SMC condensin I complex, subunit D2 non-SMC condensin I complex, subunit G non-SMC condensin I complex, subunit G NCK-associated protein 1 NDC80 homolog, kinetochore complex component nudE nuclear distribution gene E homolog 1 (A. nidulans) nuclear paraspeckle assembly transcript 1 nuclear paraspeckle assembly transcript 1 nei endonuclease VIII-like 3 (E. coli) NIMA (never in mitosis gene a)-related kinase 2 NIMA (never in mitosis gene a)- related kinase 9 nexilin (F actin binding protein) neurofibromin 1 nuclear factor I/X (CCAAT-binding transcription factor) nuclear transcription factor Y, alpha nidogen 1 NIPA-like domain containing 3 nipsnap homolog 1 (C. elegans) non-metastatic cells 4, protein expressed in

202472_at 209280_at 203781_at 224877_s_at 235783_at 210360_s_at

0,586 0,620 1,248 — 1,863 2,156

4,2 2,7 23,2 — 9,5 5,8

0,566 0,503 1,930 1,994 2,821 0,784

6,1 0,8 2,3 3,4 4,5 45,3

1,051 2,153 1,783 1,961 — 2,225

59,1 1,4 1,6 3,5 — 4,4

202086_at

0,210

5,8

0,349

7,9

0,504

17,3

204994_at 224920_x_at 201319_at 32811_at 207895_at 201970_s_at 223284_at 224771_at 201774_s_at 218662_s_at 218663_at 217465_at 204162_at 222625_s_at 214657_s_at 224566_at 219502_at 211080_s_at 214738_s_at 1552309_a_at 204325_s_at 227400_at 204107_at 202008_s_at 225875_s_at 201708_s_at 212739_s_at

0,306 1,094 2,017 1,366 0,582 0,431 0,316 0,642 0,487 0,178 0,063 2,076 0,058 0,552 1,483 1,343 0,207 0,143 0,658 1,802 1,138 1,307 0,631 0,650 1,503 0,623 0,623

2,4 55,5 2,4 15,3 4,8 0,0 1,4 4,2 1,6 0,0 0,0 2,0 0,0 1,4 23,2 26,5 0,0 0,0 7,0 5,8 58,8 54,8 7,0 8,0 8,0 2,7 4,2

0,467 1,800 2,220 2,511 0,609 0,640 0,660 2,082 0,543 0,970 0,739 0,338 0,855 0,442 0,414 0,580 0,635 0,460 0,103 2,078 0,460 2,275 0,459 0,489 1,462 0,471 0,621

9,0 9,0 0,4 0,6 4,5 6,8 7,9 2,0 3,8 49,0 17,7 0,0 29,0 0,7 6,1 6,1 6,8 3,4 0,0 2,3 0,5 3,4 0,8 1,7 12,7 0,2 6,8

0,546 1,899 1,174 1,542 1,292 0,630 1,508 0,579 0,558 0,358 0,451 0,313 0,516 1,353 0,245 0,440 0,586 0,643 0,917 0,825 0,638 2,858 1,329 1,495 1,562 1,299 1,760

19,0 4,4 38,5 8,2 26,2 17,3 11,7 5,7 10,3 1,4 7,3 1,2 5,7 26,2 1,6 3,9 5,7 19,0 40,4 34,3 9,0 1,3 20,9 22,6 9,0 19,0 2,7

nucleolar protein 12 /// TRIO and F-actin binding protein

219324_at

0,608

4,2

0,801

31,5

0,603

9,0

non-POU domain containing, octamer-binding Notch homolog 2 (Drosophila) neurexin 2 nuclear receptor binding SET domain protein 1 NOL1/NOP2/Sun domain family, member 3 nudix (nucleoside diphosphate linked moiety X)-type motif 1 nudix (nucleoside diphosphate linked moiety X)-type motif 21 NUF2, NDC80 kinetochore complex component, homolog nucleolar and spindle associated protein 1 nucleolar and spindle associated protein 1 2',5'-oligoadenylate synthetase 1, 40/46kDa 2'-5'-oligoadenylate synthetase 2, 69/71kDa 2'-5'-oligoadenylate synthetase 2, 69/71kDa 2'-5'-oligoadenylate synthetase 2, 69/71kDa 2'-5'-oligoadenylate synthetase 3, 100kDa 2'-5'-oligoadenylate synthetase-like 2'-5'-oligoadenylate synthetase-like opioid growth factor receptor-like 1 Opa interacting protein 5 olfactory receptor, family 2, subfamily A, member 20 pseudogene /// olfactory receptor, family 2, subfamily A, member 5 /// olfactory receptor, family 2, subfamily A,

210470_x_at 210756_s_at 209982_s_at 243612_at 219458_s_at 204766_s_at

0,658 0,593 0,690 0,783 0,765 0,541

9,5 3,4 17,7 32,6 15,3 1,4

0,368 0,303 2,236 0,535 0,617 0,609

0,5 0,0 7,9 7,9 3,4 6,1

0,991 0,918 3,656 0,405 0,627 0,887

62,0 47,4 0,0 3,9 8,2 43,9

202697_at

0,621

2,7

0,640

4,5

1,043

61,3

223381_at 219978_s_at 218039_at 205552_s_at 228607_at 206553_at 204972_at 218400_at 205660_at 210797_s_at 238469_at 213599_at

0,079 0,091 0,094 0,164 0,444 0,335 0,183 0,186 0,248 0,235 1,903 0,176

0,0 0,0 0,0 7,0 0,9 0,7 1,4 0,4 1,2 1,6 7,0 0,0

0,580 0,476 0,589 0,226 0,516 0,221 0,315 0,216 0,348 0,316 0,456 1,190

7,9 2,3 5,2 9,0 4,5 1,0 5,2 0,8 3,8 4,5 1,5 55,8

0,437 0,533 0,536 0,439 0,488 0,593 0,736 0,540 0,660 0,685 0,501 0,531

3,9 11,7 4,4 26,2 10,3 15,8 32,3 22,6 30,2 40,4 6,3 9,0

222290_at

0,741

26,5

0,562

7,9

0,404

6,3

151

Anhang OR2A9P ORAI2 ORC6L OSBPL1A OSBPL1A P2RX4 P2RY6 P4HB PADI2 PANX1 PARP14 PARVB PATL1 PATL1 PBK PBX1 PCDH7 PCDHB5 PCF11 PCGF2 PCNX PCTK1 PCTK1 PCTK3 PDE7A PDGFA PDS5B PEX14 PEX26 PFDN1 PGD PHACTR2 PHACTR2 PHB PHF17 PHF19 PHKB PHLDA1 PIGY PIK3R1 PILRB PINK1 PLCD4 PLCXD1 PLEKHA2 PLK1 PLK4 PLK4 PLTP PMAIP1 PMEPA1 POLD3 POLE2 PPP2R1A PPP4C PRDM1 PRDX2 PREX1 PRIC285 PRKCD PRKDC PSMB9 PSMC2 PSMD1

member 9 pseudogene ORAI calcium release-activated calcium modulator 2 origin recognition complex, subunit 6 like (yeast) oxysterol binding protein-like 1A oxysterol binding protein-like 1A purinergic receptor P2X, ligand-gated ion channel, 4 pyrimidinergic receptor P2Y, G-protein coupled, 6 prolyl 4-hydroxylase, beta polypeptide peptidyl arginine deiminase, type II pannexin 1 poly (ADP-ribose) polymerase family, member 14 parvin, beta protein associated with topoisomerase II homolog 1 (yeast) protein associated with topoisomerase II homolog 1 (yeast) PDZ binding kinase pre-B-cell leukemia homeobox 1 protocadherin 7 protocadherin beta 5 PCF11, cleavage and polyadenylation factor subunit, homolog polycomb group ring finger 2 pecanex homolog (Drosophila) PCTAIRE protein kinase 1 PCTAIRE protein kinase 1 PCTAIRE protein kinase 3 Phosphodiesterase 7A platelet-derived growth factor alpha polypeptide PDS5, regulator of cohesion maintenance, homolog B peroxisomal biogenesis factor 14 peroxisomal biogenesis factor 26 prefoldin subunit 1 phosphogluconate dehydrogenase phosphatase and actin regulator 2 phosphatase and actin regulator 2 prohibitin PHD finger protein 17 PHD finger protein 19 phosphorylase kinase, beta pleckstrin homology-like domain, family A, member 1 phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis, class Y phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 1 (alpha) paired immunoglobin-like type 2 receptor beta PTEN induced putative kinase 1 phospholipase C, delta 4 phosphatidylinositol-specific phospholipase C, X domain containing 1 pleckstrin homology domain containing, family A, member 2 polo-like kinase 1 (Drosophila) polo-like kinase 4 (Drosophila) polo-like kinase 4 (Drosophila) phospholipid transfer protein phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1 prostate transmembrane protein, androgen induced 1 polymerase (DNA-directed), delta 3, accessory subunit polymerase (DNA directed), epsilon 2 (p59 subunit) protein phosphatase 2, regulatory subunit A, alpha isoform protein phosphatase 4 (formerly X), catalytic subunit PR domain containing 1, with ZNF domain peroxiredoxin 2 phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate-dependent Rac exchange factor 1 peroxisomal proliferator-activated receptor A interacting complex 285 protein kinase C, delta protein kinase, DNA-activated, catalytic polypeptide proteasome (prosome, macropain) subunit, beta type, 9 (large multifunctional peptidase 2) proteasome 26S subunit, ATPase, 2 proteasome 26S subunit, non-ATPase, 1

152

231406_at 219105_x_at 209485_s_at 208158_s_at 204088_at 208373_s_at 1564494_s_at 1554384_at 204715_at 224701_at 216253_s_at 225468_at 235235_s_at 219148_at 212148_at 210273_at 223629_at

0,825 0,346 1,687 2,066 0,534 1,600 0,649 0,393 0,943 0,390 0,421 0,635 0,623 0,060 1,588 1,968 0,352

23,2 0,0 8,0 1,4 1,6 23,2 9,5 9,5 43,8 2,7 5,8 8,0 2,7 0,0 26,5 9,5 2,0

1,989 0,797 2,596 2,268 0,645 0,554 0,361 0,374 1,900 0,436 0,241 0,356 0,244 0,806 0,390 0,450 1,720

1,0 31,5 2,8 2,8 4,5 7,9 0,6 6,1 7,9 5,2 0,6 0,4 0,0 29,0 6,1 1,1 12,7

1,636 0,532 0,501 0,517 1,181 0,342 1,585 1,226 1,683 0,541 2,268 0,744 0,944 0,469 0,368 2,356 0,374

2,5 7,3 10,3 6,3 43,9 2,2 11,7 45,7 7,3 15,8 2,2 28,4 43,9 7,3 7,3 9,0 7,3

227622_at

0,322

0,0

0,605

7,9

0,838

38,5

203792_x_at 213159_at 207239_s_at 208824_x_at 214797_s_at 230500_at 205463_s_at 204742_s_at 33760_at 219180_s_at 201507_at 201118_at 204049_s_at 244774_at 200658_s_at 225820_at 227212_s_at 242248_at 217999_s_at 224661_at 212239_at 220954_s_at 209018_s_at 224505_s_at

0,649 0,564 0,647 0,642 0,408 0,411 0,529 0,640 0,871 1,615 0,950 0,608 2,305 9,303 0,859 2,113 0,569 0,447 0,581 0,614 3,797 0,481 1,646 0,399

7,0 2,0 8,0 9,5 2,0 1,0 3,4 5,8 20,4 5,8 50,7 4,8 1,0 0,9 32,6 1,6 1,6 5,8 8,0 9,5 0,3 7,0 7,0 4,2

0,502 0,621 0,331 0,371 0,299 0,319 2,531 1,067 0,642 2,323 0,627 0,488 0,584 1,924 0,640 3,323 0,623 0,506 0,446 0,972 2,235 0,526 0,566 0,527

2,3 5,2 0,2 0,5 0,6 1,7 0,6 49,0 2,8 0,7 6,1 0,8 9,0 7,9 7,9 1,5 6,8 7,9 0,8 56,9 3,8 2,8 2,3 9,0

2,540 0,881 1,848 1,862 4,803 0,945 1,871 0,619 0,655 1,426 0,594 1,074 0,391 1,821 0,613 1,400 1,228 1,157 1,108 0,496 1,060 1,235 1,637 0,456

0,0 40,4 2,2 3,2 1,4 28,4 3,9 9,0 6,3 9,0 6,3 60,5 2,7 59,1 7,3 28,4 36,5 50,6 59,8 7,3 59,1 56,7 5,7 9,0

218951_s_at

0,369

1,0

0,541

5,2

1,330

38,5

238013_at 202240_at 204887_s_at 211088_s_at 202075_s_at 204285_s_at 217875_s_at 212836_at 205909_at 200695_at 208932_at 228964_at 211658_at

0,623 0,157 0,103 0,127 0,619 0,390 0,417 0,535 0,374 1,507 0,921 1,275 0,770

8,0 0,0 0,0 0,0 9,5 2,7 0,4 0,9 0,0 4,8 41,2 38,3 32,6

0,324 0,248 0,506 0,241 0,326 0,431 3,485 0,897 0,911 0,354 0,399 0,414 0,401

0,4 0,2 4,5 0,5 0,2 2,3 1,3 45,3 38,8 0,0 0,2 1,7 1,5

1,241 0,666 0,483 0,689 2,394 0,514 2,593 0,653 0,346 1,562 0,573 0,509 0,451

42,2 20,9 6,3 30,2 1,9 10,3 0,0 8,2 2,2 6,3 4,4 9,0 5,7

224909_s_at

0,251

1,2

0,292

1,0

2,391

2,5

228230_at

0,320

0,3

0,404

0,7

1,151

61,3

202545_at 210543_s_at

0,522 0,788

4,2 13,2

0,569 0,567

5,2 2,3

1,472 0,551

14,2 4,4

204279_at

0,534

2,0

0,588

3,8

0,829

30,2

201067_at 201198_s_at

1,294 1,086

23,2 52,6

0,507 0,642

1,5 7,9

0,456 0,534

1,6 4,9

Anhang PSMD11 PSPC1 PTCD1 PTCD3 PTGFR PTGR1 PTMA PTPN18 PTPRM PTTG1 PXK QKI RABL2A /// RABL2B RACGAP1 RAD51AP1 RAD51L3 RAD52 RAD54B RARA RAVER1 RBM15B RBM25 RBMXL1 RCC1 /// SNHG3RCC1 RCL1 RCN3 RFC3 RFXANK RGNEF RGS4 RNF126 RNF144A RNF145 RNPEPL1 RP6213H19.1 RPL29 RPL32P3 RPL37A RPS4X RPS6KB1 RPS9 RPUSD3 RRBP1 RRM2 RSAD2 RTKN RTP4 RUVBL1 SAMHD1 SC65 SCARA3 SCARA3 SCARA3 SCLT1 SDC1 SDC3 SELENBP1 SEMA4B SENP7 SEPN1 SEPT13 SEPT9 SERBP1 SFRS1

proteasome 26S subunit, non-ATPase, 11 paraspeckle component 1 pentatricopeptide repeat domain 1 Pentatricopeptide repeat domain 3 prostaglandin F receptor (FP) Prostaglandin reductase 1 prothymosin, alpha protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 18 protein tyrosine phosphatase, receptor type, M pituitary tumor-transforming 1 PX domain containing serine/threonine kinase Quaking homolog, KH domain RNA binding (mouse) RAB, member of RAS oncogene family-like 2A /// RAB, member of RAS oncogene family-like 2B Rac GTPase activating protein 1 RAD51 associated protein 1 RAD51-like 3 (S. cerevisiae) RAD52 homolog (S. cerevisiae) RAD54 homolog B (S. cerevisiae) retinoic acid receptor, alpha ribonucleoprotein, PTB-binding 1 RNA binding motif protein 15B RNA binding motif protein 25 RNA binding motif protein, X-linked-like 1

208777_s_at 222611_s_at 222796_at 228512_at 1555097_a_at 242775_at 211921_x_at 203555_at 1555578_at 203554_x_at 1552275_s_at 241938_at

0,832 0,942 2,145 0,756 0,415 0,607 0,389 0,560 2,136 0,151 0,610 0,541

23,2 54,1 5,8 9,5 7,0 7,0 0,0 4,2 2,0 0,0 5,8 4,8

0,593 0,365 1,812 1,797 0,259 0,735 1,640 0,618 2,922 0,545 0,624 0,502

3,8 0,7 6,8 3,4 0,8 22,2 6,8 5,2 1,7 3,8 9,0 4,5

0,570 0,503 — 1,701 0,850 0,419 0,630 1,316 1,384 0,649 0,736 0,975

4,9 8,2 — 8,2 47,4 1,9 9,0 17,3 58,6 10,3 24,3 58,6

220500_s_at

0,607

8,0

0,521

5,2

1,467

19,0

222077_s_at 204146_at 209965_s_at 205647_at 219494_at 203749_s_at 223425_at 202689_at 1557081_at 227748_at

0,301 0,187 0,445 0,515 0,420 0,787 0,539 0,874 0,642 0,881

0,0 0,0 0,5 2,7 1,2 17,7 9,5 32,6 5,8 38,3

0,738 0,704 0,603 0,689 0,747 1,611 0,331 1,569 1,656 0,621

15,9 17,7 4,5 14,3 22,2 9,0 1,7 6,8 11,1 6,8

0,473 0,384 0,929 0,510 0,548 2,694 2,009 1,707 0,472 0,535

2,7 1,4 47,4 4,9 7,3 0,6 3,5 4,4 2,2 5,7

regulator of chromosome condensation 1 /// SNHG3-RCC1 readthrough transcript

206499_s_at

1,080

54,8

1,706

9,0

2,504

1,4

RNA terminal phosphate cyclase-like 1 reticulocalbin 3, EF-hand calcium binding domain replication factor C (activator 1) 3, 38kDa regulatory factor X-associated ankyrin-containing protein Rho-guanine nucleotide exchange factor regulator of G-protein signaling 4 ring finger protein 126 ring finger protein 144A ring finger protein 145 arginyl aminopeptidase (aminopeptidase B)-like 1

222666_s_at 219102_at 204127_at 202758_s_at 1560348_at 204338_s_at 205748_s_at 204040_at 238949_at 218301_at

0,577 0,653 0,402 0,570 2,002 2,472 0,665 0,277 0,953 0,877

4,8 2,0 0,0 1,0 2,7 8,0 9,5 0,9 52,6 35,6

0,573 0,466 0,760 0,531 0,520 0,230 0,352 0,521 2,777 1,837

3,4 0,5 24,5 1,7 3,8 1,5 0,4 6,8 0,5 2,8

1,087 1,365 0,438 0,734 1,708 0,195 1,678 0,620 2,252 1,687

61,9 19,0 2,7 17,3 6,3 4,4 10,3 15,8 1,6 3,5

serine/threonine protein kinase MST4

224407_s_at

0,185

0,2

0,247

0,2

1,165

56,7

ribosomal protein L29 ribosomal protein L32 pseudogene 3 Ribosomal protein L37a ribosomal protein S4, X-linked ribosomal protein S6 kinase, 70kDa, polypeptide 1 ribosomal protein S9 RNA pseudouridylate synthase domain containing 3 ribosome binding protein 1 homolog 180kDa (dog) ribonucleotide reductase M2 radical S-adenosyl methionine domain containing 2 rhotekin receptor (chemosensory) transporter protein 4 RuvB-like 1 (E. coli) SAM domain and HD domain 1 synaptonemal complex protein SC65 scavenger receptor class A, member 3 scavenger receptor class A, member 3 scavenger receptor class A, member 3 sodium channel and clathrin linker 1 syndecan 1 syndecan 3 selenium binding protein 1 sema domain, immunoglobulin domain (Ig), transmembrane domain (TM) and short cytoplasmic domain, 4B SUMO1/sentrin specific peptidase 7 selenoprotein N, 1 Septin 13 septin 9 SERPINE1 mRNA binding protein 1 splicing factor, arginine/serine-rich 1

216570_x_at 235314_at 214041_x_at 216342_x_at 204171_at 214317_x_at 225743_at 201203_s_at 201890_at 242625_at 225150_s_at 219684_at 201614_s_at 204502_at 204078_at 223843_at 219416_at 223842_s_at 236487_at 201287_s_at 202898_at 214433_s_at

0,890 0,453 1,645 1,118 0,636 0,428 0,665 0,616 0,071 0,142 0,658 0,291 0,563 0,469 0,624 0,393 0,655 0,393 0,631 0,354 — 0,488

32,6 0,0 2,7 48,6 9,5 1,2 4,2 3,4 0,0 3,4 9,5 4,8 1,4 9,5 1,0 2,7 9,5 1,0 0,7 4,2 — 2,0

1,791 0,613 2,105 1,590 0,807 0,945 0,541 0,353 0,712 0,219 0,385 0,390 0,579 0,368 1,593 0,601 0,345 0,320 1,208 0,338 2,715 0,423

4,5 5,2 2,3 9,0 29,0 55,8 2,8 0,2 26,8 6,8 1,1 9,0 6,1 3,8 4,5 12,7 0,4 0,2 29,0 2,8 5,2 0,8

2,170 0,862 1,152 1,589 0,554 0,477 1,095 1,633 0,383 0,507 1,404 0,602 0,535 0,518 1,748 0,505 0,724 0,773 0,651 0,972 3,407 0,738

6,3 36,5 47,4 4,9 4,9 6,3 60,7 6,3 4,9 28,4 22,6 28,4 4,9 15,8 2,5 7,3 17,3 26,2 9,0 60,7 1,6 22,6

234725_s_at

0,418

2,4

0,626

7,9

1,170

40,4

220735_s_at 224659_at 1569974_x_at 207425_s_at 210076_x_at 208863_s_at

0,662 0,471 1,573 0,782 2,382 0,552

4,2 2,4 4,2 43,8 1,4 2,7

0,408 0,402 1,738 2,403 1,320 0,702

1,3 1,3 6,1 6,8 29,0 19,8

0,962 1,483 1,128 5,114 2,034 0,415

50,6 12,8 53,2 0,0 8,2 3,2

153

Anhang SFRS1 SFRS3 SFRS7 SFXN3 SGOL2 SGOL2 SHCBP1 SHFM1 SLC17A9 SLC17A9 SLC1A3 SLC24A3 SLC25A14 SLC25A40 SLC29A1 SLC5A3 SLC5A3 SLC5A5 SLC9A5 SMC2 SMC4 SMO SMTN SMYD3 SNAI1 SNRPA SNTB1 SOLH SORBS2 SORD SOX12 SPAG5 SPC25 SPIN4 SPSB2 SRGAP1 SSBP4 SSX2IP SSX2IP ST3GAL2 STIP1 STRA13 STRN3 SUZ12P TACC3 TAF4B TAPBP TBL1X TBRG1 TBRG1 TCF19 TCF4 TDP1 TEAD2 TEAD2 TEF TFG TGFB2 TGFB2 THBS1 THBS1 TIA1 TIMM17B TK1 TK1 TLR3 TMEFF2

splicing factor, arginine/serine-rich 1 Splicing factor, arginine/serine-rich 3 splicing factor, arginine/serine-rich 7, 35kDa sideroflexin 3 shugoshin-like 2 (S. pombe) shugoshin-like 2 (S. pombe) SHC SH2-domain binding protein 1 split hand/foot malformation (ectrodactyly) type 1 solute carrier family 17, member 9 solute carrier family 17, member 9 solute carrier family 1, member 3 solute carrier family, member 3 solute carrier family 25, member 14 solute carrier family 25, member 40 solute carrier family 29, member 1 solute carrier family 5, member 3 solute carrier family 5, member 3 solute carrier family 5, member 5 solute carrier family 9, member 5 structural maintenance of chromosomes 2 structural maintenance of chromosomes 4 smoothened homolog (Drosophila) smoothelin SET and MYND domain containing 3 snail homolog 1 (Drosophila) small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A syntrophin, beta 1 small optic lobes homolog (Drosophila) sorbin and SH3 domain containing 2 sorbitol dehydrogenase SRY (sex determining region Y)-box 12 sperm associated antigen 5 SPC25, NDC80 kinetochore complex component, homolog spindlin family, member 4 splA/ryanodine receptor domain and SOCS box containing 2 SLIT-ROBO Rho GTPase activating protein 1 single stranded DNA binding protein 4 synovial sarcoma, X breakpoint 2 interacting protein synovial sarcoma, X breakpoint 2 interacting protein ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 2 stress-induced-phosphoprotein 1 stimulated by retinoic acid 13 homolog (mouse) striatin, calmodulin binding protein 3 Suppressor of zeste 12 homolog pseudogene transforming, acidic coiled-coil containing protein 3 TAF4b RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)associated factor, 105kDa TAP binding protein (tapasin) transducin (beta)-like 1X-linked transforming growth factor beta regulator 1 transforming growth factor beta regulator 1 transcription factor 19 transcription factor 4 tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 TEA domain family member 2 TEA domain family member 2 thyrotrophic embryonic factor TRK-fused gene transforming growth factor, beta 2 transforming growth factor, beta 2 Thrombospondin 1 thrombospondin 1 TIA1 cytotoxic granule-associated RNA binding protein translocase of inner mitochondrial membrane 17 homolog B thymidine kinase 1, soluble thymidine kinase 1, soluble toll-like receptor 3 transmembrane protein with EGF-like and two follistatin-like domains 2

154

201742_x_at 232392_at 201129_at 220974_x_at 230165_at 235425_at 219493_at 202276_at 232922_s_at 233328_x_at 1569054_at 219090_at 211855_s_at 227012_at 201801_s_at 212944_at 213167_s_at 211123_at 220650_s_at 204240_s_at 201663_s_at 218629_at 207390_s_at 218788_s_at 219480_at 201770_at 208608_s_at 204275_at 204288_s_at 201562_s_at 204432_at 203145_at 209891_at 228654_at 223580_at 1555875_at 229269_x_at 203017_s_at 203015_s_at 205346_at 213330_s_at 209478_at 215505_s_at 236386_at 218308_at

0,672 0,404 0,658 0,653 0,184 0,166 0,088 0,710 0,508 0,421 0,314 0,312 0,977 0,440 0,432 0,500 0,480 2,330 2,120 0,907 0,212 0,493 0,551 2,434 0,404 0,450 0,476 0,535 0,542 0,656 1,315 0,161 0,051 0,547 1,566 1,989 0,936 0,435 0,631 0,571 0,658 0,542 2,028 0,602 0,091

20,4 0,9 9,5 5,8 0,0 0,0 0,0 11,2 1,4 4,2 2,0 8,0 54,1 0,2 5,8 7,0 5,8 2,7 3,4 38,3 0,0 1,6 9,5 3,4 2,4 0,0 7,0 2,4 4,8 2,4 29,6 0,0 0,0 2,7 8,0 4,2 43,8 0,4 4,2 2,7 3,4 1,4 8,0 8,0 0,0

0,321 0,422 0,836 0,625 0,752 1,616 0,687 0,564 0,304 0,363 0,136 1,039 0,596 0,815 0,327 1,162 0,161 1,818 1,479 0,574 0,479 0,581 0,439 1,017 0,510 0,618 0,387 0,393 0,618 0,611 2,105 0,809 0,735 0,932 1,559 0,561 1,537 0,856 0,500 0,414 0,349 0,877 6,218 0,269 0,532

0,6 1,3 41,3 5,2 17,7 15,9 12,7 2,8 0,2 2,8 0,2 53,5 7,9 24,5 2,0 36,2 0,2 19,8 22,2 2,0 1,7 2,8 3,4 55,8 6,1 5,2 2,8 0,7 9,0 3,4 3,8 26,8 22,2 50,6 14,3 11,1 9,0 38,8 2,8 1,0 0,2 38,8 0,2 0,8 3,4

0,473 0,768 0,562 0,918 0,501 0,607 0,461 0,447 1,259 1,467 1,496 0,247 0,606 0,541 1,886 0,456 0,575 2,718 2,267 0,556 0,563 1,438 2,197 2,649 1,426 1,364 2,360 2,159 1,290 1,348 3,806 0,548 0,515 0,554 1,584 2,308 1,555 0,573 1,347 1,109 0,818 0,461 — 0,568 0,797

8,2 28,4 9,0 49,0 4,4 9,0 4,9 1,9 28,4 17,3 36,5 9,0 9,0 4,4 8,2 9,0 15,8 1,6 1,4 6,3 10,3 12,8 1,9 1,2 34,3 14,2 3,2 0,9 30,2 24,3 0,0 7,3 9,0 4,4 8,2 1,6 4,9 9,0 55,6 62,0 26,2 2,2 — 9,0 28,4

235020_at

1,078

54,1

1,977

3,4

1,743

9,0

208829_at 201868_s_at 226318_at 242701_at 223274_at 212385_at 219715_s_at 226408_at 238323_at 225840_at 221871_s_at 220407_s_at 209908_s_at 235086_at 201110_s_at 1554890_a_at 203342_at 202338_at 1554408_a_at 206271_at

0,584 0,444 0,649 0,464 0,247 0,804 0,642 0,458 0,321 1,534 1,601 0,312 0,285 1,871 1,534 0,506 0,630 0,124 0,145 0,481

2,4 2,7 7,0 2,7 0,0 26,5 4,2 0,2 3,4 17,7 5,8 1,0 4,8 5,8 4,2 3,4 5,8 0,0 0,0 7,0

0,414 0,400 0,635 0,547 0,585 0,612 0,403 0,601 0,199 1,804 0,375 0,498 0,073 2,437 2,416 0,313 0,619 0,566 0,448 1,099

0,4 2,0 7,9 6,1 7,9 6,1 0,2 4,5 0,2 6,8 0,5 7,9 0,2 4,5 0,8 0,4 6,8 4,5 1,1 43,5

1,193 1,341 0,711 1,425 0,601 0,511 0,792 1,533 1,797 1,987 0,490 0,820 1,106 0,808 1,440 0,507 1,270 0,639 0,835 0,510

45,7 26,2 17,3 50,6 11,7 4,4 22,6 8,2 6,3 4,9 5,7 50,6 53,2 43,9 9,0 7,3 26,2 10,3 32,3 9,0

224321_at

2,504

5,8

5,282

0,0

2,200

1,4

Anhang TMEM143 TMEM173 TMEM223 TMEM30A TMEM41B TMEM47 TMEM49 TMPO TMPO TMSB15B TMTC1 TNFRSF19 TNFSF10 TNFSF4 TOP1 TOP2A TOP2A TPCN2 TPX2 TRA2B TRAM1L1 TRERF1 TRIB3 TRIM2 TRIM21 TRIM28 TRIM69 TRNP1 TRO TROAP TTC26 TTK TUBB TUBB TUBB TUBGCP3 TUG1 TWF1 TYMS UBA7 UBE2C UBE2O UBE2T UBE2W UBE2W UHRF1 UHRF1BP1 L ULK1 UNC5B USP1 USP1 USP21 USP21 USP53 VEGFA VEGFA VPS13D VPS36 VRK1 WBSCR22 WDHD1 WDR76 WDR89 WHSC1 WHSC1 XAF1 XAF1 YARS

transmembrane protein 143 transmembrane protein 173 transmembrane protein 223 transmembrane protein 30A transmembrane protein 41B transmembrane protein 47 transmembrane protein 49 thymopoietin thymopoietin thymosin beta 15B transmembrane and tetratricopeptide repeat containing 1 tumor necrosis factor receptor superfamily, member 19 tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10 tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 4 topoisomerase (DNA) I topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa two pore segment channel 2 TPX2, microtubule-associated, homolog (Xenopus laevis) transformer 2 beta homolog (Drosophila) translocation associated membrane protein 1-like 1 transcriptional regulating factor 1 tribbles homolog 3 (Drosophila) tripartite motif-containing 2 tripartite motif-containing 21 tripartite motif-containing 28 tripartite motif-containing 69 TMF1-regulated nuclear protein 1 trophinin trophinin associated protein (tastin) tetratricopeptide repeat domain 26 TTK protein kinase tubulin, beta tubulin, beta tubulin, beta tubulin, gamma complex associated protein 3 taurine upregulated 1 (non-protein coding) Twinfilin, actin-binding protein, homolog 1 (Drosophila) thymidylate synthetase ubiquitin-like modifier activating enzyme 7 ubiquitin-conjugating enzyme E2C ubiquitin-conjugating enzyme E2O ubiquitin-conjugating enzyme E2T (putative) ubiquitin-conjugating enzyme E2W (putative) ubiquitin-conjugating enzyme E2W (putative) ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1

222905_s_at 224929_at 220934_s_at 222391_at 212622_at 209656_s_at 1569003_at 209754_s_at 209753_s_at 214051_at 226931_at 224090_s_at 202688_at 207426_s_at 208900_s_at 201291_s_at 201292_at 235194_at 210052_s_at 210180_s_at 244334_at 238520_at 218145_at 215945_s_at 204804_at 200990_at 1568592_at 227862_at 205028_at 204649_at 233999_s_at 204822_at 211714_x_at 212320_at 209026_x_at 215739_s_at 228397_at 214008_at 1554696_s_at 203281_s_at 202954_at 218141_at 223229_at 218521_s_at 222656_at 225655_at

0,627 1,070 0,694 1,581 1,573 1,810 0,471 0,252 0,378 0,262 0,651 0,363 0,325 0,963 0,617 0,076 0,068 0,995 0,256 1,333 0,638 0,528 0,566 1,452 0,648 0,548 0,608 3,149 0,308 0,087 0,593 0,066 0,617 0,597 0,577 0,640 0,608 1,503 0,169 0,473 0,110 0,849 0,212 1,776 1,539 0,101

4,8 58,8 9,5 2,4 5,8 1,4 3,4 0,0 0,2 0,0 9,5 7,0 1,6 46,3 4,2 0,0 0,0 54,1 0,0 35,6 9,5 4,2 43,8 5,8 1,0 4,2 9,5 0,6 0,7 0,0 5,8 0,0 3,4 2,7 2,0 2,4 9,5 23,2 0,0 0,2 0,0 32,6 0,0 2,4 7,0 0,0

0,516 0,361 3,071 2,016 1,730 1,659 0,316 0,214 0,481 0,982 0,383 0,325 0,366 2,467 2,189 0,633 0,650 0,383 0,351 0,604 1,232 0,682 2,245 0,663 0,499 0,323 0,578 1,991 0,484 0,597 0,528 0,544 0,627 0,594 0,587 0,450 1,257 0,284 0,527 0,536 0,604 1,934 0,546 2,310 1,826 0,803

1,5 0,2 0,4 1,5 9,0 9,0 0,6 0,0 2,3 57,7 2,0 4,5 1,5 9,0 0,8 7,9 7,9 2,0 0,7 7,9 38,8 17,7 9,0 6,8 0,8 0,2 6,8 5,2 3,8 9,0 5,2 3,8 6,8 3,4 4,5 0,3 31,5 1,3 2,3 1,5 9,0 5,2 6,1 0,8 6,8 33,6

0,933 0,633 1,748 0,958 1,268 1,204 1,198 0,820 0,919 0,522 1,383 1,402 0,513 1,672 0,463 0,372 0,642 0,437 0,620 0,596 0,573 0,502 2,158 0,446 0,601 1,759 0,699 1,222 0,775 0,674 0,686 0,548 1,046 1,100 1,236 1,158 0,314 0,169 0,959 0,994 0,748 2,372 0,669 1,010 1,151 0,389

47,4 9,0 4,9 54,5 42,2 36,5 42,2 38,5 54,5 7,3 28,4 49,0 10,3 7,3 4,9 2,7 11,7 5,7 12,8 9,0 6,3 6,3 7,3 6,3 5,7 3,9 20,9 38,5 22,6 19,0 20,9 6,3 60,9 53,2 38,5 47,4 1,2 0,0 53,2 54,5 24,3 1,4 17,3 62,0 43,9 4,4

UHRF1 binding protein 1-like

1554291_at

0,954

46,3

1,615

7,9

1,952

9,0

unc-51-like kinase 1 (C. elegans) unc-5 homolog B (C. elegans) ubiquitin specific peptidase 1 ubiquitin specific peptidase 1 ubiquitin specific peptidase 21 ubiquitin specific peptidase 21 ubiquitin specific peptidase 53 vascular endothelial growth factor A vascular endothelial growth factor A vacuolar protein sorting 13 homolog D (S. cerevisiae) vacuolar protein sorting 36 homolog (S. cerevisiae) vaccinia related kinase 1 Williams Beuren syndrome chromosome region 22 WD repeat and HMG-box DNA binding protein 1 WD repeat domain 76 WD repeat domain 89 Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 1 Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 1 XIAP associated factor 1 XIAP associated factor 1 tyrosyl-tRNA synthetase

209333_at 226899_at 202412_s_at 202413_s_at 218367_x_at 234735_s_at 216775_at 210513_s_at 211527_x_at 212326_at 222478_at 203856_at 207628_s_at 216228_s_at 205519_at 244038_at 222777_s_at 209052_s_at 228617_at 206133_at 238760_at

0,634 0,350 0,518 0,597 0,614 0,613 3,877 0,476 0,354 1,139 0,663 0,432 0,913 0,645 0,404 0,651 0,515 0,399 0,292 0,494 0,411

4,2 1,2 0,7 0,5 4,8 8,0 4,2 9,5 2,4 43,8 4,8 0,6 38,3 5,8 0,5 7,0 0,3 0,3 0,0 2,7 5,8

0,625 2,249 0,625 1,120 0,488 0,593 1,412 0,398 0,324 0,583 0,983 0,857 0,624 0,768 0,562 0,502 0,848 0,232 1,019 0,818 0,455

7,9 7,9 5,2 43,5 1,0 7,9 36,2 4,5 2,0 6,8 55,8 41,3 3,8 19,8 3,8 1,7 33,6 0,0 60,1 31,5 3,4

1,516 1,799 0,471 0,622 1,117 1,711 2,608 2,159 2,470 0,423 0,511 0,573 0,627 0,558 0,687 0,827 0,574 0,943 0,556 0,558 0,749

11,7 6,3 3,9 4,4 53,2 4,4 8,2 3,9 2,5 7,3 1,9 8,2 5,7 8,2 17,3 36,5 3,9 56,7 9,0 8,2 32,3

155

Anhang ZAK ZBTB7A ZDHHC20 ZDHHC21 ZFHX4 ZFPM2 ZNF232 ZNF367 ZNF641 ZNF642 ZNF680 ZNF691 ZNF776 ZNF785 ZNF800 ZNF814 ZNF93 ZSWIM1 ZWILCH ZWILCH ZWINT

sterile alpha motif and leucine zipper containing kinase AZK zinc finger and BTB domain containing 7A zinc finger, DHHC-type containing 20 zinc finger, DHHC-type containing 21 zinc finger homeobox 4 zinc finger protein, multitype 2 zinc finger protein 232 zinc finger protein 367 zinc finger protein 641 zinc finger protein 642 zinc finger protein 680 zinc finger protein 691 zinc finger protein 776 zinc finger protein 785 zinc finger protein 800 zinc finger protein 814 zinc finger protein 93 zinc finger, SWIM-type containing 1 Zwilch, kinetochore associated, homolog (Drosophila) Zwilch, kinetochore associated, homolog (Drosophila) ZW10 interactor

225662_at 226554_at 225365_at 241946_at 241700_at 219778_at 219123_at 229551_x_at 226509_at 1569107_s_at 229533_x_at 232780_s_at 228652_at 1554770_x_at 227101_at 60794_f_at 215758_x_at 223607_x_at 218349_s_at 222606_at 204026_s_at

1,528 1,165 1,173 0,964 0,604 1,592 0,606 0,160 0,485 0,659 0,425 0,332 1,683 0,715 1,635 0,825 0,640 1,632 0,416 0,443 0,340

1,6 38,3 43,8 46,3 3,4 26,5 1,6 0,0 7,0 8,0 0,3 1,4 8,0 13,2 7,0 26,5 7,0 11,2 0,0 0,0 0,2

2,345 1,958 0,489 0,427 0,706 0,577 0,657 0,670 0,887 1,254 1,515 0,436 1,678 2,330 1,657 0,544 0,553 1,886 0,219 0,797 0,788

0,8 2,3 2,8 0,8 12,7 6,8 4,5 19,8 45,3 33,6 15,9 2,0 7,9 0,6 9,0 2,8 5,2 5,2 0,0 26,8 31,5

1,875 2,094 0,447 0,478 0,380 0,380 0,903 0,349 0,542 0,522 0,612 0,718 0,863 2,117 1,177 0,492 1,104 2,044 0,423 0,530 0,383

1,4 0,6 4,9 7,3 1,4 2,2 43,9 2,2 5,7 4,4 4,4 19,0 42,2 4,9 38,5 4,4 60,2 4,4 1,6 3,9 4,4

Angegeben sind die Genexpressionsänderungen (FC) jeweils im Vergleich zu hMSC-K und die Falsch-Positiv-Rate (q) in Prozent. Rot unterlegte Werte bedeuten eine erhöhte Expression des Genprodukts (FC > 1,5), grün bedeutet eine erniedrigte Expression (FC < 0,667) bei einem q-Wert

[PDF] Molekulare Analysen zur Knochenregeneration im Alter und bei Osteoporose - Free Download PDF (2024)

References